Genome-wide investigation of defensin genes in apple(Malus×domestica Borkh.) and in vivo analyses show that MdDEF25 confers resistance to Fusarium solani

Apple replant disease is a complex soil syndrome that occurs when the same fields are repeatedly utilized for apple orchard cultivation.It can be caused by various pathogens,and Fusarium solani is the main pathogen.Fusarium solani disrupts the structure and function of the orchard soil ecosystem and inhibits the growth and development of apple trees,significantly impacting the quality and yield of apples.In this study,we conducted a transcriptome comparison between uninoculated apple saplings and those inoculated with F:solani.The differentially expressed genes were mainly enriched in processes such as response to symbiotic fungus.Plant defensins are antimicrobial peptides,but their roles during F.solani infection remain unclear.We performed a genome-wide identification of apple defensin genes and identified 25 genes with the conserved motif of eight cysteine residues.In wildtype apple rootstock inoculated with F.solani,the root surface cells experienced severe damage,and showed significant differences in the total root length,total root projection area,root tips,root forks,and total root surface area compared to the control group.qRT-PCR analysis revealed that MdDEF3 and MdDEF25 were triggered in response to F.solani infection in apples.Subcellular localization showed specific expression of the MdDEF3-YFP and MdDEF25-YFP proteins on the cell membrane.Overexpressing theMdDEF25-YFP fusiongene enhanced resistance against F.solani in apple,providing a new strategy for the future prevention and biological control of apple replantdisease.

糖尿病大鼠肝脏β-defensins表达及血清炎症因子的变化

目的:观察糖尿病大鼠病程中肝脏β-defensins的表达和血清炎症因子的变化,探讨在糖尿病状态时两者之间可能存在的影响.方法:实验大鼠分为普通饲料组、高糖饲料组、糖尿病4wk组和12wk组,采集血液检测血清炎症因子TNF-α,IL-1β及IL-10和血糖、胰岛素、三酰甘油等相关生化指标;收集肝脏标本,RT-PCR及Western Blot方法检测β-defensins的表达.结果:与对照组相比,糖尿病大鼠整个病程中都存在致炎因子TNF-α,IL-1β激活及抗炎因子IL-10的削弱.肝脏中表达β-defensins1(rBD-1)和β-defensins2(rBD-2).rBD-1呈少量表达,糖尿病病程中rBD-2表达呈减少趋势.高血糖或糖基化反应可能干扰rBD-2的组成性表达及炎症因子产生的诱导性表达.结论:糖尿病大鼠病程中存在慢性炎症,高血糖或糖基化反应干扰了炎症刺激重要的小分子抗菌肽β-defensins在肝脏表达的信号通路,使其表达下调.

黄芪甲甙对吸烟大鼠气道-defensin 2表达的影响

目的了解熏烟对大鼠肺组织β-防御素2(β-defensin2)表达的影响,黄芪甲甙对β-defensin2表达的调控作用及其可能的机制。方法大鼠接受染毒柜被动吸烟三周,建立熏烟模型。分别给于黄芪甲甙1.2mg/kg·d,2.4mg/kg·d,3.6mg/kg·d灌胃。提取肺组织和支气管肺泡灌洗液,采用免疫组化、RT-PCR等方法检测β-defensin 2的表达水平。结果吸烟可以使气道上皮β-defensin 2表达升高,使BALF中炎细胞总数,中性粒细胞,巨噬细胞,淋巴细胞数增高。黄芪甲甙可以降低吸烟诱导的β-defensin 2的高表达,减少支气管肺泡灌洗液白细胞及中性粒细胞,淋巴细胞的数量。结论黄芪甲甙下调吸烟诱导的气道上皮β-defensin 2的高表达,减轻气道炎症。

家蝇幼虫抗菌肽Defensins基因的克隆与序列分析

目的克隆家蝇幼虫的抗菌肽defensins基因并对其进行序列分析。方法提取家蝇幼虫总RNA,根据家蝇成虫defensins基因cDNA序列设计一对引物,RT-PCR扩增目的基因片段,T-A克隆后测序,应用相关生物信息学软件对该序列进行分析。结果RT-PCR扩增出一条约310bp的目的片段,序列分析表明,其与家蝇成虫防御素基因同源性高达97%,核酸序列变异主要发生在信号肽区域。结论成功克隆及分析了家蝇幼虫防御素基因全长编码区cDNA序列,为其下一步的重组表达和生物活性研究奠定了基础。

家蝇抗菌肽Defensin基因同向串联表达载体的构建和鉴定

目的:构建家蝇抗菌肽Defensin基因多拷贝串联体,并克隆到甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K上。方法:PCR法扩增家蝇抗菌肽Defensin基因成熟肽片断,目的片断的上游5′端带有EcoRⅠ和NheⅠ位点,下游5′端带有NotⅠ和XbaⅠ位点,目的片断首先克隆入pMD18-T载体,利用pMD18-T载体的NdeⅠ位点和目的片断上的一对同尾酶(NheⅠ和XbaⅠ),多次酶切连接,串联成多拷贝的Defensin成熟肽基因,再用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,最后克隆入甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K。结果:PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证明多拷贝基因重组质粒构建成功。结论:该方法能方便高效地获得所需的多拷贝基因,为进一步进行高效表达打下基础。

家蝇抗菌肽defensin对人肝癌细胞HepG2的增殖、凋亡和周期的影响

采用四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）比色法，分析家蝇抗菌肽defensin对人肝癌细胞HepG2体外生长增殖与凋亡的影响，用倒置光学显微镜检测defensin对人肝癌细胞HepG2和人正常心肌细胞H9C2生长增殖情况的影响，并采用流式细胞术检测defensin对人肝癌细胞HepG2细胞凋亡及细胞周期的影响。结果显示，家蝇抗菌肽defensin对人肝癌细胞HepG2的生长有抑制作用，对人正常心肌细胞H9C2无抑制作用。通过显微镜观察HepG2细胞凋亡的形态变化，MTT检测发现defensin对肿瘤细胞的增殖抑制率呈剂量反应关系和时间反应关系。defensin能诱导人肝癌细胞HepG2发生凋亡，并且影响人肝癌细胞HepG2的细胞周期。家蝇抗菌肽defensin对人肝癌细胞HepG2具有增殖抑制作用及凋亡作用，对正常人心肌细胞H9C2基本无抑制作用。

中国南方汉族人β-defensin-1基因多态性与慢性阻塞性肺疾病易感性的关系

目的 探讨中国南方汉族人 β- defensin- 1基因多态性与慢性阻塞性肺疾病 (COPD)易感性的关系。方法 采用限制性片段长度多态性 (RFLP)技术检测 β defensin -1外显子 2基因型在 12 0例COPD吸烟患者和10 8例非COPD吸烟者中的频率。结果 COPD组同源野生型 (G/G)、杂合型 (G/A)和同源突变型 (A/A)频率分别为 82 .5 0 %、10 .83%和 6 .6 7% ,非COPD组的频率分别为 95 .37%、3.70 %和 0 .93% ,两组基因频率分布的差异有显著性 (P <0 .0 1)。两组等位基因的分布差异也有显著性 (等位基因G频率分别为 87.92 %∶97.2 2 % ;等位基因A频率分别为 12 .0 8%∶2 .78% ;P <0 .0 1) ;G→A的突变率随COPD病情的严重度增加而上升。结论 β defensin 1基因外显子 2的 16 5 4位多态性与中国南方汉族人群COPD易感性可能有关 ,而且可能还影响COPD的进展。

白纹伊蚊和埃及伊蚊defensin A基因克隆及序列分析

应用PCR技术从白纹伊蚊和埃及伊蚊基因组中扩增出defensinA基因 ,并与文献报道的defensinA的5个型的cDNA序列进行同源性比较 ,发现此两序列中存在内元 ;从埃及伊蚊体内扩增的片段为蚊虫defen sinAl的前体AaDefAl;从白纹伊蚊体内扩增的片段为defensinA的 1个新型 ,命名为DefA6。

家蝇抗菌肽Defensin在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

拟通过酵母系统表达家蝇抗菌肽Defensin基因,并初步鉴定其抗菌活性。采用限制性内切酶SacⅠ将分泌型重组表达质粒pPIC9K/Defensin线性化后,运用氯化锂转化法将其转入巴斯德毕赤酵母GS115中,行G418加压筛选和PCR鉴定;所得阳性转化子转至摇瓶,28℃条件下0.5%甲醇诱导表达,连续诱导培养4 d后,上清液进行Tricine-SDS-PAGE检测表达效果,并采用琼脂糖孔穴扩散法检测表达产物对大肠杆菌E.coliK12D31的抑制作用。结果显示,家蝇抗菌肽Defensin在毕赤酵母中得到了成功表达,表达产物对大肠杆菌E.coliK12D31的生长有抑制作用。说明酵母系统适合抗菌肽的表达。

大劣按蚊感染约氏疟原虫defensins基因的克隆及生物信息学分析

目的为探讨大劣按蚊对约氏疟原虫侵入的免疫反应,克隆大劣按蚊的抗菌肽defensins基因并对基因序列进行生物信息学分析。方法分别提取感染疟原虫的大劣按蚊的蚊胃总RNA,根据冈比亚按蚊defensins基因设计、合成简并引物,进行RT-PCR扩增目的片段,TA克隆后测序并进行序列分析。结果用简并引物的RT-PCR扩增出约氏疟原虫感染的大劣按蚊的189bp目的片段,序列分析表明与冈比亚按蚊defensins有87%同源性,与白蚊伊蚊defensinsD有88%同源性,为大劣按蚊的defensins基因。结论成功克隆并分析了大劣按蚊抗菌肽defensins基因,为进一步的重组表达和研究按蚊抗菌肽的生物活性奠定基础。

家蝇防御素defensin cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

提取家蝇总RNA,RT-PCR扩增编码家蝇防御素defensin的cDNA,克隆并测定了其序列,将该cDNA序列与酵母表达载体pPICZαA重组,构建酵母分泌型表达载体pPICZα-de,电激法转化毕赤酵母(Pichia pasto-ris)受体菌GS115。经表型筛选和PCR鉴定证明目的片段已稳定整合到酵母染色体基因组中。在含不同浓度的Zeoc in平板上筛选到高拷贝整合的转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达,用Tric ine-SDS-PAGE确定了表达产物的正确性,琼脂孔穴平板扩散法、比浊法测定了表达产物的活性,对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有一定的杀菌活性。

Defensin抗菌肽的序列特性分析

对defensin抗菌肽进行了生物信息学分析.一级结构表明其具有典型的昆虫防御素特征.二级结构分析表明defensin抗菌肽中主要的结构元件为α-螺旋,但有例外.信号肽及导肽分析结果显示defensin抗菌肽均属于分泌型蛋白.通过对不同物种defensin抗菌肽的分析结果表明,非阳离子抗菌肽的作用机制可能是疏水作用力起主导作用或者是对细菌胞内酶结构与功能、对细菌胞内信号转导的影响有关.

家蝇抗菌肽Defensin基因在COS-7细胞中的瞬时表达

目的:研究家蝇抗菌肽Defensin cDNA在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达情况,并对表达产物的抗菌作用进行初步检测。方法:以Defensin基因为模板设计特异性引物,扩增在C端含6×His标签的Defensin开放阅读框序列,将此序列与真核表达载体pcDNA3.1(+)进行重组,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/Defensin-His 6。以阳离子脂质体LipofectamineTM2000为载体,对宿主细胞COS-7进行重组质粒pcDNA3.1(+)/Defensin-His 6和空载体pcDNA3.1(+)的转染,72h后收集细胞培养上清液,表达产物经His-Trap HP亲合层析柱分离纯化和Western blotting鉴定后,进行杀菌活性的初步检测。结果:重组质粒pcDNA3.1(+)/Defensin-His 6组细胞培养上清液的纯化物,行Western blotting得到了分子量大小约为10.0kD的单一目的条带,与预期相符;杀菌活性试验中发现:该纯化物对大肠杆菌E.coliK12D31具有一定的杀菌活性。结论:家蝇抗菌肽Defensin基因在宿主细胞COS-7中得到了正确表达。

白纹伊蚊和埃及伊蚊防御素(defensin)成熟肽基因克隆及结构推测

应用PCR技术从白纹伊蚊和埃及伊蚊基因组中扩增出defensin成熟肽基因并对其分子生物学特性进行分析 ,发现埃及伊蚊 (BoraBora株、海口株 )、白纹伊蚊 (成都株、宜兴株、广州株 )推导的氨基酸序列与埃及伊蚊defensinA相同 ;通过Chou Fasman预测法对defensinA成熟肽的二级结构进行预测 ,可以看出在defensin成熟肽氨基酸序列的 15～ 2 3位有一个α 螺旋 ,35～ 39位有一个 β 折叠 ,32～ 34位有一个转角 ;

家蝇幼虫Defensin成熟蛋白序列的克隆及在原核中的表达

目的 克隆家蝇幼虫defensin成熟蛋白编码序列并在大肠杆菌中表迭,为进一步的研究该基因的功能奠定基础。 方法 以家蝇幼虫cDNA文库为模板扩增出defensin基因的成熟蛋白全长编码序列,构建重组原核表达载体pGEX／MDEF,转化的克隆(质粒)通过筛选并测序鉴定。重组的pGEX／MDEF在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE鉴定其表达情况和分子质量并用抗鼠GST单抗作western blot杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。 结果 以家蝇幼虫cDNA文库扩增出一条长约为140bp的cDNA片段,经测序证实其为defensin基因成熟蛋白的编码序列,它编码含40个氨基酸的蛋白质,预测其分子质量单位为4kD。被成功克隆入pGEX-4T-1载体的家蝇幼虫defensin基因的cD-NA,在重组大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量生成相对分子质量30KD融合蛋白。 结论 成功构建了家蝇幼虫de-fensin基因原核表达载体,且其成熟蛋白的编码序列在大肠杆菌高效表达。为下一步表达蛋白纯化,以及研究其生物活性提供了材料。

防御素(Defensin)研究进展

防御素 (Defensin)是近年来发现的广泛存在于动物和植物体内的一类阳离子抗菌活性肽。它们通常都是由 2 8～ 54个氨基酸残基组成 ,分子内富含精氨酸和由半胱氨酸形成的分子内二硫键。它们具有广谱高效的杀菌活性 ,能有效地杀灭革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、某些真菌、螺旋体、被膜病毒等微生物 ,因而对它们的研究已成为当前国际学术界中一个引人关注的研究热点。本文将简述有关防御素的分布、分子结构特征、生物学活性、作用机制、分子生物学特征等方面的研究概况及展望。

实验感染登革Ⅱ型病毒的2种蚊媒RT-PCR检测defensinA结果分析

白纹伊蚊和埃及伊蚊在经口大剂量感染登革Ⅱ型病毒 1天、 2天、 3天和 11天后 ,用RT PCR方法都未能在其体内检测到defensinA的mRNA的表达 ,提示登革Ⅱ型病毒感染其有效媒介宿主白纹伊蚊和埃及伊蚊后并不诱导defensinA的表达 ,或者表达量极低用RT PCR方法不能检测到。

一类新型的抗菌活性肽──生物防御素(Defensin)

生物防御素（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）是近年来发现的一组新型抗菌活性肽。它们通常都是由３５～５０个氨基酸残基组成，且分子内富含二硫键。由于其具有牢固的分子骨架、广泛的分布以及生物活性功能，因而对它们的研究已成为当前国际学术界中一个引人关注的研究热点。本文将简述有关生物防御素的分布、分子结构特征、生物活性及其可能的作用机制等方面的研究概括及展望。

Defensin α1对大鼠系膜细胞增殖的影响

目的:探讨defensin α1对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞株1097增殖的影响以及可能的机制。方法:利用MTT掺入观察不同浓度的基因重组人类defensin α1在不同作用时间对系膜细胞增殖的影响,选择能够刺激系膜细胞生长的浓度及作用时间给予U0126预孵育,观察能否阻断defensin α1促系膜细胞增殖作用,使用Western blotting了解defensin α1对系膜细胞ERK1/2磷酸化及Ⅳ型胶原合成的影响。结果:Defensin α1在3-20mg/L范围内对系膜细胞具有促生长作用,12h达到峰值(P<0.01)。当浓度大于20mg/L时可抑制系膜细胞的生长,浓度在15-25μmol/L U0126可以阻断defensin α1对系膜细胞的促生长作用。浓度为3mg/L defensin α1刺激5min后可使ERK1/2磷酸化明显增加,作用12h后系膜细胞的IV胶原蛋白表达高于对照组并持续到48h(P<0.01)。结论:一定浓度的defensin α1可以促进系膜细胞的增殖和细胞外基质的合成,这种促增殖作用可能是通过MAPK途径实现的。

昆虫防御素基因(defensin)的起源与分子进化

果蝇防御素基因位于它的第二条染色体右臂上,其编码产物具有抗菌肽活性,主要对革兰氏阳性菌有抗性。由于其有牢固的分子骨架、广泛的分布以及生物活性,对它的研究已成为当前国际研究热点。本文主要使用NCBI的资源分析黑腹果蝇防御素及其同源序列,并讨论了昆虫防御素的起源和分子进化。