LPS及IL-1β对组织工程化口腔黏膜中HBD-2和HBD-3表达的影响

目的:研究在大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和重组人白细胞介素1(interleukin-1,IL-1β)刺激下,组织工程化口腔黏膜替代品中的人β防御素2(Human-beta-defensin-2,HBD-2)和人β防御素3(Human-beta-defensin-3,HBD-3)的表达,评估组织工程化口腔黏膜治疗感染性口腔疾病的可能性。方法:采用实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)和免疫印迹试验(Western blot)评估在LPS和IL-1β刺激下,组织工程化口腔黏膜替代品中HBD-2和HBD-3基因及蛋白的表达情况。采用SPSS 26.0软件包对数据进行统计学分析。结果:LPS和IL-1β均可刺激组织工程化口腔黏膜中HBD-2和HBD-3基因及蛋白的表达,培养24 h后呈现出剂量依赖性增加的趋势(P<0.05)。在100 ng/mL的LPS刺激下,HBD-2基因表达增加约2.7倍,而HBD-3基因表达增加约5倍;在20 ng/mL的IL-1β刺激下,HBD-2基因表达增加约1.6倍,而HBD-3基因表达增加约4.8倍。Western blot结果显示,LPS和IL-1β均可显著诱导HBD-2和HBD-3蛋白的分泌。结论:组织工程化口腔黏膜替代品在一定程度上具备抵御入侵微生物的防御功能,应用组织工程化口腔黏膜可为感染性口腔疾病提供新的治疗思路。

寻常型银屑病患者皮损中HBD-2和TNF-α的表达及意义

目的:探讨寻常型银屑病皮损中人β防御素2(HBD-2)与肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达及其相关性。方法:采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测45例寻常型银屑病患者的皮损组织、非皮损组织以及15例正常人皮肤组织中HBD-2 mRNA及TNF-αmRNA的表达。结果:寻常型银屑病皮损组HBD-2 mRNA和TNF-αmRNA表达显著高于非皮损组和正常对照组。在皮损组HBD-2 mRNA与TNF-αmRNA的表达呈正相关,且二者的表达均与患者PASI评分成正相关。结论:HBD-2和TNF-α在寻常型银屑病发病中可能起相互协同的作用,加重了银屑病的炎症反应。

清热益气方治疗衣原体感染性宫颈炎的疗效及对hBD-2基因表达的影响

目的研究清热益气方治疗衣原体感染性宫颈炎的临床疗效及对人β防御素-2(hBD-2)基因表达的影响。方法衣原体感染性宫颈炎患者60例,随机分为中药治疗组与西药对照组各30例,中药组采用清热益气方,西药组用强力霉素胶囊,共治疗14d观察疗效。采用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测两组患者的宫颈中hBD-2基因的表达情况。结果清热益气方与强力霉素对衣原体感染性宫颈炎疗效相当,总有效率为73.3%。但对hBD-2基因表达的影响差异有显著统计学意义(P<0.01),清热益气方能调节其表达增强,强力霉素对其影响较弱。结论清热益气方治疗衣原体感染性宫颈炎疗效较好,能增强宫颈粘膜hBD-2 mRNA的表达。

人源肽抗生素hBD-2表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

为了构建人源肽抗生素hBD 2的表达质粒并在大肠杆菌中表达 ,将化学合成的hBD 2全基因插入原核融合蛋白表达质粒 pinpointXa 3的多克隆位点构建成表达质粒 ,按常规方法转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性重组子并诱导融合蛋白的表达。结果经酶切鉴定获得 7个阳性克隆 ,序列分析表明其中 4个克隆的插入序列与hBD 2基因完全一致 ,另 3个克隆插入序列的 39位由C突变为T ,89位多了一个G。正确的阳性克隆子在大肠杆菌中产生了约 18kD的特异性诱导蛋白。hBD 2的成功表达为进一步研究hBD 2的抗菌活性、抗菌机理打下了一定的基础。

溃疡性结肠炎和肠易激综合征结肠黏膜HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23的表达

目的探讨溃疡性结肠炎和肠易激综合征患者结肠黏膜HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23的表达及临床意义。方法选择溃疡性结肠炎(UC组)和腹泻型肠易激综合征(腹泻型IBS组)各40例,另选择正常对照组20例,取结肠黏膜标本采用免疫组化SP法进行HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23染色。结果 UC组HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23阳性率及表达均显著高于腹泻型IBS组和对照组(P<0.05),UC组不同病情程度之间HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23阳性率差异有统计学意义(P<0.05),HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23表达均与病情程度呈正相关(P<0.05),而腹泻型IBSIL-6和IL-23阳性率及表达与轻度UC差异无统计学意义(P>0.05)。UC患者黏膜HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23表达之间均呈正相关(P<0.05)。结论 HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23在UC结肠黏膜中高表达,参与UC的发生发展过程,而IL-6和IL-23在IBS结肠黏膜中高表达,IBS黏膜炎症改变与轻度UC相似,IBS与UC之间存在相关性。

人抗菌肽HBD-2的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

制备人β-防御素2(HBD-2)多克隆抗体,以用于HBD-2蛋白水平表达的检测。提取人肠腺上皮细胞株Caco-2总RNA,设计引物,应用RT-PCR从其总RNA中扩增HBD-2成熟肽cDNA片段,以pGEX-1λT为载体,构建原核表达质粒pGEX-1λT-HBD-2。大肠杆菌裂解物经亲合层析纯化后获得分子量约30kDa的融合蛋白,将此融合蛋白免疫新西兰兔,并用正辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,ELISA法显示抗血清对HBD-2的效价为1∶12800,Western印迹显示抗血清可识别HBD-2。本实验结果证明应用重组融合小肽代替白蛋白或甲状腺-肽偶联免疫可获得其高效价的识别HBD-2的多克隆抗体,为今后从蛋白质水平研究HBD-2基因的诱导表达,包括组织分布和基因表达调控等研究打下了基础。

参苏饮含药血清对炎症人支气管上皮细胞表达hBD-2、TLR4、NFκBp65mRNA的实验研究

目的探讨参苏饮含药血清对炎症人支气管上皮细胞(16HBE)表达hBD-2、TLR4、NFκBp65mRNA的影响。方法选择雄性SD大鼠,灌胃给予参苏饮及其拆方药液,心脏采血制备含药血清;传代培养人支气管上皮细胞(16HBE);LPS(1mg/L)刺激16HBE后不同时间点(3,6,12,24h)测定细胞增殖活性及培养上清液中TNF-α、IL-8含量,建立16HBE炎症模型;采用RT-PCR法检测给药后不同时间点(0.5,1,3,5,8h)细胞hBD-2mRNA、TLR4 mRNA、NFκBp65mRNA的表达情况。结果与空白对照组比较,模型组的hBD-2mRNA相对表达量在1,3,5h显著性升高(P<0.05),且在3h达峰值;与模型组比较:全方组及益气解表组的h BD-2mRNA相对表达量在1,3,5h均显著性升高(P<0.05),且在3h达峰值;止咳化痰组的hBD-2mRNA相对表达量仅在1h、5h显著性升高(P<0.05),且全方组较益气解表组和止咳化痰组升高明显;与空白对照组比较,模型组的TLR4mRNA相对表达量在3h后显著性升高(P<0.05);与模型组比较:全方组、益气解表组的TLR4mRNA相对表达量在3h后显著性升高(P<0.05);止咳化痰组的TLR4mRNA相对表达量在5h后显著性升高(P<0.05),且全方组较益气解表组和止咳化痰组升高明显;与空白对照组比较,模型组的NFκBp65mRNA相对表达量在1h后显著性升高(P<0.05);与模型组比较,全方组、益气解表组、止咳化痰组的NFκBp65mRNA相对表达量在3h、5h显著性升高(P<0.05)。结论参苏饮能在不同时间点不同程度的上调炎症16HBE细胞表达TLR4 mRNA、NFκBp65mRNA、hBD-2mRNA,且全方组的效应优于拆方组。表明参苏饮能促进hBD-2表达与TLR4-NFκB通路有很大的相关性。

细菌性阴道病hBD-2 mRNA表达的变化及微生态制剂、中药对其影响

目的研究细菌性阴道病(BV)患者hBD-2 mRNA表达量的变化和微生态制剂、中药提取物对其的影响。方法将BV患者随机分为4组,即健康对照组(n=10)、BV组(n=10)、微生态制剂治疗组(n=8)和中药治疗组(n=7)。采用RT-PCR半定量法,检测阴道组织hBD-2 mRNA的水平。结果与健康对照组相比,BV组、微生态制剂治疗组和中药提取物治疗组hBD-2 mRNA的水平明显升高(P<0.05);微生态制剂治疗组和中药治疗组hBD-2 mRNA的水平平均分别较BV组增高(P<0.05)。结论微生态制剂和中药对BV患者治疗可以使hBD-2 mRNA表达水平上调,提示其在维系正常妇女生殖道内环境稳定、宿主天然抗感染机制中起着重要的作用。

脂质相关膜蛋白体外诱导绒毛膜hBD-2基因表达的研究

目的探讨UU的LAMPs对β-防御素表达分泌量与作用时间的研究。方法应用LAMPs体外诱导绒毛膜hBD-2基因表达,RT-PCR检测hBD-2mRMA表达。结果不同浓度的LAMPs均能明显诱导绒毛膜产生hBD-2,相同浓度的LAMPS刺激绒毛膜12h,24h绒毛膜的HBD-2mRNA表达量不同。结论绒毛膜HBD-2mRNA表达与LAMPs呈明显的剂量依赖性;24h内绒毛膜的HBD-2mRNA表达呈现出时间依赖性。

防御素HBD-2在口腔白斑病损中表达的研究

目的:探讨口腔白斑(OLK)患者病损中的防御素HBD-2的表达,以分析HBD-2在OLK发病机制与上皮抗感染免疫中的作用。方法:采用免疫组织化学技术(IHC)检测8例OLK病损组织,6例对照组织中HBD-2多肽的表达,并进行分析。结果:HBD-2在所有样本中均出现了阳性胞浆染色,健康口腔黏膜组中HBD-2蛋白为弱阳性染色,与呈强阳性染色的OLK组差异有统计学意义(P<0.05)。结论:健康口腔黏膜组织也有少量HBD-2表达,提示其作为机体先天性免疫的组成部分,在维持口腔黏膜健康上具有一定作用。在OLK的病理过程中HBD-2上调表达而参与了OLK的发病过程,HBD-2有可能与癌前病变有相关性。

支原体性宫颈炎粘膜HBD-2mRNA的表达

目的探讨支原体感染的非淋菌性宫颈炎患者人β防御素-2(hBD-2)的表达。方法采用RT-PCR法对10例患者皮损hBD-2mRNA检测,并以10例正常组织做对照。结果正常人和患者均可检测到hBD-2mRNA表达,但支原体感染的非淋菌性宫颈炎患者表达比明显增多。结论hBD-2参与了支原体性宫颈炎发病过程。

HBD-2转基因小鼠的建立及鉴定

人β防御素2(Hum an beta defens in 2,HBD-2)是人体抗菌肽的重要分子,体外试验研究证明具有广谱抗微生物活性,为开展其在整体水平上的功能研究,建立HBD-2转基因小鼠模型。用分子克隆方法构建了带CM V启动子的HBD-2全长cDNA真核重组表达质粒pCDNA 3.1-HBD 2,以此为摸板,PCR扩增出带CM V启动子和BGHpo lyA尾的HBD-2基因片段,用显微注射技术将此微基因导入小鼠雄原核中,于M 16培养液培养后经输卵管移植到受体鼠体内让其怀孕产生子代小鼠。PCR法检测外源基因在小鼠基因组中的整合,RT-PCR和免疫组化法检测HBD-2在小鼠组织的表达。PCR检测结果显示17只F0代转基因鼠中4只检测到阳性信号,RT-PCR和免疫组化检测显示HBD-2在其F1代转基因小鼠生殖道、呼吸道、泌尿道以及血管内皮等组织部位广泛表达。实验表明HBD-2基因已整合到小鼠基因组且广泛表达,为进一步研究HBD-2的生物学功能及基因调控提供了有用的整体动物模型。

延龄草总皂苷通过促进人β防御素2(HBD-2)的表达抑制HuH-7细胞侵袭和迁移

目的探讨延龄草总皂苷调控人β防御素2(HBD-2)对HuH-7细胞侵袭和迁移的影响和机制。方法采用(0.5、1.0、2.0、4.0)mg/L延龄草总皂苷处理HuH-7细胞,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,TranswellTM小室测定细胞侵袭和迁移能力,Western blot法检测细胞中HBD-2、基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9的蛋白水平。将HBD-2小干扰RNA(siRNA)转染至HuH-7细胞中,用延龄草总皂苷处理,实时定量PCR和Western blot法验证干扰效果,TranswellTM法分别检测细胞侵袭和迁移能力。结果除0.5 mg/L延龄草总皂苷对HuH-7细胞增殖无影响外,其他各剂量延龄草总皂苷均可抑制HuH-7细胞增殖。(0.5、1.0)mg/L的延龄草总皂苷处理均可下调细胞MMP2、MMP9蛋白水平、增加HBD-2蛋白水平并抑制细胞侵袭和迁移。HBD-2 siRNA转染可明显降低HuH-7细胞HBD-2水平。下调HBD-2提高延龄草总皂苷处理的HuH-7细胞侵袭和迁移能力并增加细胞MMP2、MMP9蛋白水平。结论延龄草总皂苷通过促进HBD-2表达抑制HuH-7细胞侵袭和迁移。

β-防御素hBD-2研究进展

抗生素的滥用带来严重的病菌耐药性问题。肽抗生素有多种抗微生物活性，且不易出现耐药性。通过对β-防御素hBD-2的基因结构、体内体外炎症部位的表达、功能的回顾分析，明确了β-防御素hBD-2的应用前景及发展方向，科研人员应致力于基因克隆表达的技术，研究开发hBD-2。

寻常型银屑病患者皮损中HBD-2、IL-1β和NF-κBp65表达的研究

目的:探讨HBD-2、IL-1β和NF-κBp65在寻常型银屑病皮损中的表达及其在银屑病中的作用机制。方法:采用SP免疫组化法检测45例银屑病患者皮损区、非皮损区及15例正常人皮肤中HBD-2、IL-1β和NF-κBp65的表达,对其在皮损中的表达进行相关性分析,并将结果与PASI评分进行相关性分析。结果:银屑病患者皮损区HBD-2、IL-1β、NF-κBp65的表达比非皮损区、正常人皮肤明显上调,非皮损区HBD-2、IL-1β的表达也高于正常人皮肤,差异均有统计学意义(均P<0.05)。银屑病患者皮损中HBD-2、IL-1β和NF-κBp65的表达水平与PASI评分之间均存在正相关(r=0.867、0.865、0.821,均P<0.05)。银屑病患者皮损中HBD-2与IL-1β、HBD-2与NF-κBp65、IL-1β与NF-κBp65表达水平之间均存在正相关(r=0.869、0.740、0.814,均P<0.05)。结论:HBD-2、IL-1β、NF-κBp65在寻常型银屑病皮损中的表达均升高,可能共同参与银屑病的发病过程。

HBD-1、HBD-2和NF-κBp65在红皮病银屑病皮损中的表达

目的研究HBD-1、HBD-2和NF-κBp65在银屑病红皮病皮损中的表达。方法应用免疫组织化学方法研究HBD-1、HBD-2和NF-κBp65在银屑病红皮病皮损中的表达,并与健康对照皮肤进行比较,分析HBD-1、HBD-2和NF-κBp65不同组间的表达差异,探讨HBD-2和NF-κBp65共同表达在银屑病红皮病皮损形成中的意义。结果除HBD-1外,另两种因子在银屑病红皮病皮损中的表达均高于正常对照皮肤,差异有统计学意义(P<0.01)。结论HBD-1在正常皮肤组织和红皮病皮损组织中表达差异无统计学意义(P>0.05),证明其为固有表达,与疾病的发展程度无关。HBD-2,NF-κBp65与银屑病红皮病关系密切,高表达的HBD-2,NF-κBp65可能存在相互作用和影响,促进并共同参与银屑病红皮病的发病过程。

HBD-2和IFN-γ在寻常型银屑病皮损中的表达及其意义

目的研究HBD-2、IFN-γ在寻常型银屑病皮损中的表达并探讨其意义。方法采用实时荧光定量RT-PCR法检测45例寻常型银屑病患者皮损组织、非皮损组织和15例非银屑病患者正常皮肤组织中的HBD-2和IFN-γ的mRNA表达水平,按PASI评分标准将皮损组分为轻、中、重组,检测HBD-2和IFN-γmRNA在银屑病皮损不同组中的表达水平。结果银屑病患者皮损区HBD-2、IFN-γ的表达明显上调,非皮损区HBD-2、IFN-γ的表达也高于正常皮肤组织,差异均有统计学意义(P<0.05);HBD-2、IFN-γ在轻中重不同皮损中的表达表达依次增高,差异有统计学意义。IFN-γ与HBD-2存在正相关。结论 IFN-γ和HBD-2可能共同参与了寻常型银屑病的皮损形成。