用于卵巢癌标志物β-Gal检测的荧光探针研究进展

卵巢癌是最常见的妇科癌症之一,其患者大多数在晚期被诊断出,导致卵巢癌患者的死亡率高。因此,对隐匿症状的早期诊断是患者生存率提高的重要保障。β-半乳糖苷酶(β-Gal)在原发性卵巢癌中的过表达而被认定为卵巢癌生物标志物,所以快速精准的β-Gal检测技术对卵巢癌早期诊断至关重要。近年来,荧光探针技术已成为生物体内监测和可视化的有力工具。目前已经报道了大量的用于检测β-Gal的荧光探针,但是,用于卵巢癌β-Gal检测和可视化成像的荧光探针相对较少。主要综述用于卵巢癌细胞生物标志物β-Gal检测的荧光探针的研究进展,并对探针的发展进行展望。

IgG型抗CD55×抗β-Gal基因工程双特异性抗体的构建

目的 探讨用生物学方法治疗病毒感染性疾病及肿瘤的新途径。方法 以有重要补体活化调节功能的膜补体调节蛋白CD5 5为靶点 ,以 β GaL为模拟病毒或肿瘤抗原 ,制备“IgG”型抗CD5 5×抗 β Gal基因工程双特异性抗体 ,并对该重组抗体真核表达后的结合活性进行初步的验证。结果 克隆的CD5 5抗体可变区片段为新的小鼠抗体可变区片段 ,经HEK 2 93细胞表达后的重组抗体显示了良好的CD5 5及Fc结合活性。

苹果果实β-Gal和LOX活性变化特性及其与果实软化的关系

以‘富士’和‘金冠’苹果果实为试材,研究了β-半乳糖苷酶(β-Gal)和脂氧合酶(LOX)在果实发育、成熟和软化过程中的变化规律及采后乙烯调控对其活性的影响。结果表明:在果实发育后熟过程中,金冠果实β-Gal活性显著高于富士,在果实后熟软化期间这种差异尤为突出;而富士和金冠果实LOX活性呈相似的变化规律,虽然花后富士的活性高峰显著高于金冠,但之后其活性下降迅速,并一直低于金冠。采后苹果果实β-Gal和LOX均受乙烯调控,乙烯抑制剂1-MCP极显著地抑制β-Gal和LOX的活性,而乙烯利对二者活性起促进作用,但因品种耐藏性不同其促进效应不同。综合来看,苹果果实β-Gal和LOX活性表现相似的变化规律,并且β-Gal在果实贮藏初期受乙烯的调控作用较LOX显著,因此认为在苹果果实软化早期β-Gal的作用可能大于LOX。

TGFβ信号调控阿霉素诱导的衰老肿瘤细胞表达SA-β-gal

目的:细胞衰老是维持机体稳态的一种重要机制,表达SA-β-gal被认为是衰老细胞的一种特异性的标志,但有研究表明在衰老细胞中SA-β-gal染色阳性只是衰老细胞的溶酶体变大的结果,为了探究SA-β-gal的表达与细胞衰老之间的具体关系,我们验证了参与调节衰老细胞表达SA-β-gal的信号通路及SA-β-gal的表达情况是否会对细胞衰老的过程产生影响。方法:肿瘤细胞用低剂量的阿霉素处理24小时后,再分别给予不同的小分子抑制剂继续作用4天,观察SA-β-gal染色阳性的细胞数目及SA-β-gal表达与否对于衰老细胞在分泌细胞因子、生长阻滞等细胞生物学功能上的影响。结果:在阿霉素诱导细胞发生衰老的过程中,TGFβ抑制剂SB431542能够抑制衰老细胞表达SA-β-gal,而SA-β-gal表达的缺失并不影响细胞衰老的其他特征性改变。结论:低剂量的阿霉素作用肿瘤细胞后,细胞会进入衰老的状态。在细胞衰老的过程中,TGFβ受体I的抑制剂SB431542可以抑制衰老细胞表达SA-β-gal,但是SA-β-gal的缺失表达并不影响细胞衰老的过程及衰老细胞的其他特性,如:不可逆的生长阻滞、分泌有活性的细胞因子等。结果表明:SA-β-gal并不能作为衰老细胞的特异性标志。

pET28a-TAT-LacZ重组子的构建

为了构建高表达pET28a-TAT-LacZ重组子,观察表达的融合蛋白TAT-β-Gal能否穿过生物膜,使用人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a组氨酸编码区后再连接lacZ基因,组成pET28a-TAT-LacZ重组表达子,转化大肠杆菌,利用组氨酸亲和层析柱纯化TAT-β-Gal融合蛋白,将融合蛋白加入培养的平滑肌细胞。得到高度纯化的、有活性的TAT-β-Gal融合蛋白,TAT-β-Gal在短时间内进入体外培养平滑肌细胞,成功地构建了高表达pET28a-TAT-LacZ重组子,并在体外培养的细胞中证实TAT-β-Gal融合蛋白穿透生物膜的能力,为肽类、生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。

在不同热量饮食下大鼠肾脏组织SIRT3的变化及意义

目的研究SIRT3在不同热量饮食下大鼠肾脏的表达变化规律。方法取12月龄自由饮食、热量限制、高热量饮食、健康雄性Fisher344大鼠肾组织进行衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性染色,Western印迹法(Western blot assay)和免疫组织化学法检测肾脏组织中SIRT3的表达变化与定位,并用Western blot检测p16INK4A在肾脏组织中的表达变化。结果大鼠肾脏组织SA-β-gal活性随饮食中热量的增长逐渐增强(P<0.05);p16INK4A表达随饮食中热量增加逐渐增强(P<0.05)。Western blot亦显示SIRT3蛋白表达随饮食中热量的增加逐渐减弱(P<0.05)。免疫组化结果显示,SIRT3蛋白主要表达于大鼠肾小管中,其在肾小球也有微量表达,且跟Western blot结果一致,随饮食中热量增长表达增加(P<0.05)。结论热量限制能延缓大鼠肾脏衰老,SIRT3可能与高热量引起的肾脏衰老有密切关系。

TAT-β-半乳糖苷酶对小鼠生物膜穿透性的研究

为寻找介导外源蛋白质进入组织细胞的生物学方法 ,本研究构建了pET2 8a TAT LacZ重组表达子 ,纯化得到TAT β Gal融合蛋白 ,通过腹腔注射到小鼠体内观察TAT β Gal能否穿过各组织生物膜及达到各组织的时间、浓度。结果发现TAT β Gal在短时间内可到达各组织。该研究证明在生物大分子的N 末端加上TAT具有穿透力的蛋白转导区肽段形成的融合蛋白可穿过生物膜到达各组织 ,这一发现为肽类。

光动力疗法联合手术治疗瘢痕疙瘩的初步研究

目的:研究PDT联合手术治疗瘢痕疙瘩的临床疗效和对瘢痕组织胶原及成纤维细胞老化的影响,探讨PDT对瘢痕疙瘩的治疗机制。方法:检测30例瘢痕疙瘩患者皮损组织PDT治疗前后的羟脯氨酸含量,以及β-gal含量;观察PDT联合手术治疗后12个月的临床疗效。结果:PDT可显著降低瘢痕疙瘩组织的羟脯氨酸含量,回升β-gal含量,诱导成纤维细胞老化。治疗后12个月临床症状仍具有显著改善。结论:PDT在避免致癌风险的同时保证了疗效的持久性。而且组织选择性好、创伤小,是治疗瘢痕疙瘩最有发展潜力的疗法之一。

ROSA26小鼠中枢神经系统半乳糖苷酶的表达与分布

目的:观察成年ROSA26小鼠中枢神经系统半乳糖苷酶(X-Gal)的表达与分布。方法:应用X-Gal组织化学结合尼氏染色及免疫组织化学双标技术研究β-gal在该嵌合体脑内的表达与分布特征。结果:X-Gal组织化学染色显示在该线系小鼠脑和脊髓中均广泛表达转基因β-gal活性产物,但以灰质为主。X-Gal和尼氏双重染色表明,β-gal在神经元、室管膜细胞和脉络丛上皮细胞中均有表达。免疫组化进一步显示β-gal广泛表达于神经元中,但在星形胶质细胞中则未见表达。结论:ROSA26小鼠中枢神经细胞稳定而广泛的表达β-gal,此转基因模式动物将可用于神经细胞培养、移植及其它相关神经生物学研究。

人参皂苷Rg_1诱导人白血病K562细胞复制性衰老的机制

目的探讨人参皂苷Rg1(Rg1)诱导人白血病K562细胞复制性衰老特征性变化。方法四甲基偶氮唑盐(MTT)法筛选Rg1对K562细胞增殖抑制的最佳浓度及时间,以此浓度和作用时间诱导K562细胞衰老。流式细胞术检测Rg1对细胞增殖周期的影响;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测阳性细胞百分率;Southern blotting检测端粒长度;Western blotting检测复制性衰老信号通路相关P21、P53与Rb蛋白表达;透射电镜观察人白血病K562细胞衰老超微形态学改变。结果 Rg1在体外能明显抑制K562细胞增殖,其最佳作用浓度为20μmol/L,时间为48h;诱导后的K562细胞阻滞于G2/M期;SA-β-Gal染色阳性细胞百分率增加(P<0.05);复制性衰老通路相关蛋白P21、P53和Rb表达上调(P<0.05);端粒长度缩短加速(P<0.05);经诱导细胞呈现胞体增大,溶酶体体积增大、数目增多,线粒体体积增大等衰老形态学变化。结论 Rg1可能经由p53-p21-Rb信号通路诱导K562细胞呈现复制性衰老特征。

Bmi-1基因对胃癌细胞增殖的影响及机制

目的:探索干扰Bmi-1基因后对其可能的下游基因Akt/PKB活性和P16INK4a基因表达的影响及对肿瘤细胞增殖和细胞衰老的作用.方法:用siRNA技术干扰Bmi-1表达后,运用Western blot检测Bmi-1蛋白及相关蛋白pAkt、Akt和P16INK4a的表达,同时进行SA-β-Gal染色检测细胞衰老,软琼脂克隆形成实验检测细胞的增殖能力.结果:转染Bmi-1 i质粒组平均细胞衰老率28%±3.5%,而对照Ctrli组为16%±2.7%,有明显统计学差异(P<0.01).转染Bmi-1 i质粒组细胞平均克隆形成数为3.4±1.4个,而对照Ctrli组为11±2.3个,两组比较有明显的统计学差异(P<0.01).Bmi-1 i组较Ctrli组Bmi-1和pAkt蛋白表达明显下降,而P16INK4a蛋白表达升高.结论:干扰Bmi-1可以通过降低Akt/PKB活性和上调P16INK4a蛋白表达,促进肿瘤细胞衰老并减弱肿瘤细胞的增殖能力.

透明质酸酶和油酸增强外源基因在机体内的表达

以研究外源基因有效发送至靶细胞并高效表达为目的,为了获得能提高外源基因在机体内表达量的增强剂,以pCMVβ-gal作为报告基因,分别辅以油酸和透明质酸酶两种不同的生化试剂,注射小鼠后肢腿部肌肉。通过检测在两种不同的生化试剂作用下,pCMVβ-gal在机体内表达量的差异,以期获得能提高外源基因表达量的增强剂。结果证明油酸和透明质酸酶均能有效提高pCMVβ-gal在小鼠体内的表达量,其中透明质酸酶引起的增强效果更为显著,是较好的基因表达增强剂。

广西黄鸡β-防御素Gal-4基因的克隆和体内诱导表达

采用RT-PCR方法从广西黄鸡骨髓中扩增了β-防御素Gal-4基因的cDNA片段。序列分析结果表明,获得的广西黄鸡Gal-4基因大小为321 bp,推导的Gal-4由63个氨基酸组成,其中N端20个氨基酸为信号肽,C端38个氨基酸组成Gal-4的成熟肽。另外,分析了Gal-4基因在正常广西黄鸡(对照组)和H9N2禽流感病毒感染的广西黄鸡(感染组)的肺、肝、腔上囊、十二指肠、肾、气管组织中的表达情况。分析结果表明,在检测的6个组织中,肺、十二指肠、肾组织Gal-4基因的表达在感染组和对照组之间没有明显的差别,而在肝、气管和腔上囊组织中的表达有明显差异,感染组比对照组的Gal-4阳性样品数多。在肝组织中,对照组的30个样品检测到26个阳性样品,而感染组的30个样品全都是阳性；在气管组织中,对照组30个样品检测到19个阳性样品,而感染组的30个样品检测到24个阳性样品；在腔上囊组织中,Gal-4基因的诱导表达情况非常明显,对照组30个样品中仅有9个阳性,而感染组的30个样品中有21个阳性。

定向胞内释放NO的半乳糖缀合物及其对HeLa细胞的抑制作用

目的研究糖基化NO供体-二醇二氮烯翁(d iazen ium-d iolate,NONOate)与β-半乳糖(β-galactose)的缀合物β-Gal-NONOate(β-galactosyl-d iazen iumd iolate)在肿瘤细胞中的NO释放及其对癌细胞的抑制效应。方法采用阳离子脂质体介导法,将真核表达载体pcDNA3-LacZ转染到HeLa细胞中;经G418(neomyc in)筛选,以邻-硝基苯-β-D-半乳糖苷(or-tho-n itrophenyl-beta-D-galactopyranoside,ONPG)法进行β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)活性检测,获得稳定表达β-半乳糖苷酶的HeLa细胞株;通过G riess方法比较β-Gal-NONOate与NONOate在HeLa/LacZ+细胞和HeLa细胞中NO的释放量,根据细胞克隆形成率、细胞计数和MTT法比较β-Gal-NONOate与NONOate对细胞的作用。结果β-Gal-NONOate在HeLa/LacZ+细胞中NO的释放量和细胞毒性明显高于NONOate(P<0.05),而在未转染LacZ基因的HeLa细胞中比较稳定(P>0.05)。结论β-Gal-NONOate是一个成功的定向胞内释放的NO供体,可作为研究中的新型探针,并可能在抗肿瘤治疗中发挥作用。

小鼠内耳3种溶酶体酶的定位及酶缺乏时的听力损害

目的：研究溶酶体神经氨酸酶（neuraminidase，Neu1）、保护蛋白／组织蛋白酶A（protective protein／cahepsinA，PPCA）和β-乳糖苷酶（β-galactosidase，β-al）在小鼠内耳的分布及相互影响，观察各自酶缺乏时的听功能改变。方法：分别使用出生后2个月的野生型（Neu1^＋/＋，PPCA^＋/＋和β-gal^＋/＋）小鼠各6只，年龄配对的酶基因缺乏（Neu1^-/-，PPCA^-/-和β-gal^-/-）小鼠作对照，每组6只。用听性脑干反应（ABR）测试短声（click）、短音8，16和32kHz听阈，经活体心脏灌注固定、听泡石蜡包埋和耳蜗连续切片，用免疫组织化学方法确定上述3种酶在内耳的分布情况。结果：Neu1，PPCA和β-gal在内耳不同部位的分布相类似。Neu1最强的染色主要在螺旋神经节细胞、螺旋韧带、螺旋缘、前庭神经节细胞及壶腹嵴、球囊和椭园囊感觉毛细胞，较弱的染色分布于血管纹和Corti器内、外毛细胞及支持细胞；PPCA和β-gal在螺旋神经节和前庭神经节细胞有较强的染色，血管纹、螺旋韧带、螺旋缘和Corti器内、外毛细胞及支持细胞呈较弱的染色反应；各自酶缺乏时内耳免疫染色消失。Neu1^-/-小鼠内耳PPCA和β-gal，以及β-gal^-/-小鼠Neu1和PPCA免疫反应各自无明显改变，而PPCA^-/-小鼠Neu1染色反应消失，β-gal仅存极弱的染色反应。Neu1^-/-，PPCA^-/-和β-gal^-/-小鼠听阈分别较其野生型提高约60～69dB，40～48dB和7～10dB。结论：Neu1，PPCA及β-gal分布于内耳不同组织和细胞，3种酶也以1种多酶复合物的形式存在于内耳；各自酶基因缺乏可致不同程度的听力损害。

基于酵母双杂交的微囊藻毒素检测系统初探

微囊藻毒素是由淡水微囊藻产生的次生代谢物,结构为环状七肽,分子量约1000Da,对生物机体具有多种毒理作用,是一类较强的肿瘤促进剂,目前没有比较简单便宜的藻毒素检测方法,本文探索建立利用酵母双杂交系统进行藻毒素检测的方法。前期实验已用噬菌体表面展示肽库技术从随机12和7肽库中筛选获得若干与藻毒素有相互作用的多肽。本文分别挑选其中亲和力较高的3个多肽,构建到酵母双杂交系统中,将不同的肽段分别融合在含有Ac-tive Domain和Binding Domain的表达载体中,共转化酵母菌株AH109,然后测定β-半乳糖苷酶活性来反映下游报告基因半乳糖苷酶的表达情况,从而通过反映培养基里面是否含有藻毒素,进而利用此方法来比较方便地检测藻毒素。

基因捕获成体干细胞及鉴定的初步研究

目的探讨基因捕获技术应用于成体干细胞的可行性。方法线性化逆转录病毒基因捕获载体ROSAFARY,利用Lipofectamine2000转染包装细胞PA317,LacZ染色证明转染效率后,收集病毒上清,感染种植于24孔板的小鼠成肌干细胞系C2C12、人骨髓间充质干细胞(hBMSC)。为排除潮霉素B筛选的假阳性干细胞,以C2C12、hBMSC细胞基因组DNA为模板,PCR扩增ROSAFARY上LacZ部分序列(560 bp)进行鉴定。结果ROSAFARY脂质体转染PA317细胞后LacZ染色,400倍镜下可见2-5个蓝色细胞/视野。病毒上清感染种植于24孔板的C2C12和hBMSC,4 d后经LacZ染色,C2C12可见6个蓝色细胞/孔,400倍镜下hBMSC可见4-5个蓝色细胞/视野。最佳PCR鉴定参数为基因组模板量2μg,退火温度55.5℃,Mg2+浓度3 mmol/L。结论逆转录病毒基因捕获载体感染多种成体干细胞后LacZ染色显示可成功捕获激活状态启动子驱动的基因,为基因捕获应用于成体干细胞分化及恶性转化分子机制的研究奠定了基础。

振腹环揉法对失眠大鼠下丘脑内SP、GAL、β-EP含量水平的影响

目的通过检测失眠大鼠下丘脑内的SP、GAL、β-EP的浓度,结合失眠大鼠症状改善变化,探讨振腹环揉法治疗失眠的作用机制。方法选取40只SD大鼠,随机分为空白组、模型组、推拿组,每组10只大鼠。空白组不进行造模和治疗;模型组仅造模但不治疗;推拿组造模后推拿治疗。分别在治疗5 d、10 d各处死5只大鼠采用ELISA法检测失眠大鼠下丘脑内SP、GAL、β-EP浓度,并观察失眠大鼠症状改善情况。结果造模后模型组潜睡眠时间和睡眠持续时间均有显著性差异(P<0.01)。比较SP含量,第5天与第10天比较模型组、推拿组SP含量均升高(P<0.05)。比较治疗5 d、10 d后SP含量模型组小于其他各组,且存在统计学意义(P<0.05)。比较GAL含量,模型组、推拿组第5天和第10天比较,GAL含量均升高(P<0.05)。治疗5 d后和10 d后模型组GAL含量均低于其他各组,且存在统计学意义(P<0.05)。比较β-EP含量,第5天与第10天比较,模型组、推拿组β-EP含量均增高,有统计学意义(P<0.05)。比较治疗5 d后和10 d后β-EP含量各组间比较,模型组显著低于其他各组,有统计学意义(P<0.01)。结论PCPA造模法能够模拟大鼠失眠的发生,振腹环揉法具有改善失眠大鼠模型失眠症状的作用,振腹环揉推拿疗法能够调节失眠大鼠模型下丘脑内SP、GAL、β-EP浓度治疗失眠。振腹环揉推拿疗法能改善下丘脑AS细胞排列状态调节下丘脑功能,改善昼夜节律和下丘脑能量代谢。

P53蛋白与SV40大T抗原之间相互作用的研究

为确定一种定量研究酵母体内蛋白质 -蛋白质之间相互作用的简便、快捷的方法 ,为抗癌小分子化合物药物筛选提供一条可行性途径。本文选择P5 3蛋白与SV4 0大T抗原为靶蛋白对 ,首先用酵母双杂交系统 (LiAc法质粒共转化酵母细胞 )方法定性证明了两者之间存在相互作用 ,然后通过α -半乳糖苷酶活力定量测定了相互作用力的大小 ,并确定了最佳酶活测定时间 ,并与 β-半乳糖苷酶活力测定进行了比较 ,认为α-半乳糖苷酶活力定量测定是研究蛋白质 -蛋白质间相互作用的一种更加简便快捷的方法。