牛亚科5个群体β-Lg基因PCR-RFLP分析

应用PCR-PFLP技术,分析荷斯坦奶牛、鲁西黄牛、闽南黄牛、渤海黑牛和青海牦牛5个群体741头个体β-乳球蛋白(β-Lg)基因第4外显子和β-Lg 5′侧翼区2个基因座的多态性。结果表明:前4个群体β-Lg A、B基因频率分别为0.4125/0.5875、0.1419/0.8581、0.0333/0.9667和0.1857/0.8143,β-Lg 5′侧翼区A、B基因频率分别为0.412 5/0.5875、0.7286/0.2714、0.7328/0.2672和0.8637/0.1364;牦牛β-Lg B和E基因频率为0.0732/0.9269,未发现其他等位基因。适合性检验表明:β-Lg第4外显子在荷斯坦奶牛、鲁西黄牛和渤海黑牛3个群体中已达Hardy-Weinberg平衡状态,而闽南黄牛未达到平衡状态;β-Lg 5′侧翼区位点荷斯坦奶牛群体接近平衡,其余群体均已达平衡。群体遗传学分析表明:除闽南黄牛β-Lg 5′侧翼区为低度多态外,2个位点在其余群体内均为中度多态,荷斯坦奶牛这2个位点的杂合度和期望杂合度最高,闽南黄牛最低。提示这一研究成果为开展地方遗传资源保护奠定了基础。

水牛β-LG基因3,4外显子遗传特征分析

本文通过PCR产物直接测序法得到水牛β-LG基因第3,4外显子及其旁侧序列后,采用PCR-RFLP和PCR-SSCP方法对属于10个群体的224头水牛该基因第4外显子进行了多态性检测,又从中随机抽取属于9个群体的69头水牛采用PCR-SSCP结合测序的方法检测了其第3外显子的遗传多态性。结果显示:河流型水牛和沼泽型水牛β-LG基因的第3外显子均为74 bp;它们的第4外显子均为111 bp;在所研究群体中,两类水牛第3,4外显子序列完全相同,并未发现具有多态现象。与牛科物种同源序列比较显示:水牛β-LG基因3,4外显子在进化上比较保守,相应于普通牛的B等位基因。由于产奶量有明显差异的河流型水牛与沼泽型水牛的β-LG基因第3,4外显子序列间无差异,提示它们对水牛产奶量无直接影响。

奶牛β-Lg基因第1外显子PCR-SSCP多态性与泌乳性能的相关性

采用PCR-SSCP技术并结合测序对233头奶牛β乳球蛋白(β-Lg)基因5’端部分序列和外显子1全部序列进行了多态性研究,分析了该基因与奶牛泌乳性状的相关性。结果表明:β-Lg基因5’端和外显子1共存在2个等位基因3种基因型,BB型为优势基因型,B为优势等位基因。该群体在这一位点上偏离Hardy-Weinberg平衡状态,多态信息含量(PIC)为0.3548。测序结果显示,与普通牛该基因序列(X14710)相比,B等位基因在2073 bp、2202 bp和2206 bp处发生了G→C、C→T和A→G的碱基突变,其中2202 bp处的C→T突变导致第11位氨基酸由苏氨酸变为异亮氨酸,而A等位基因在3个位点上与X14710相同。最小二乘法分析表明,BB型305 d乳蛋白量显著高于AA型和AB型(P<0.05);AB型305 d乳脂量显著高于AA型(P<0.05),BB型与AB型之间差异不显著(P>0.05);等位基因B为高乳蛋白量和乳脂量的优势基因,可作为奶牛选育的分子遗传标记。

EGCG-β-LG纳米粒的制备及体外稳定性研究

通过热诱导法制备EGCG-β-LG纳米粒,并通过单因素实验考察β-LG浓度、EGCG浓度、pH、热激温度对EGCG-β-LG纳米粒包封率的影响。按照优化后的处方配比制备EGCG-β-LG纳米粒,以保护EGCG生物活性,提高EGCG体外稳定性,并测定其包封率、粒径、Zeta电位、体外稳定性及体外释放率。结果表明pH为6.5、热激温度75℃、β-LG浓度3mg/mL、EGCG浓度0.8mg/mL是制备EGCG-β-LG纳米粒的最佳条件。EGCG-β-LG纳米粒包封率为82.61%、粒径为94.46nm、Zeta电位为-27.9mV。EGCG-β-LG纳米粒的EGCG保留率高于EGCG水溶液,其在pH5.5和pH7.4的体外释放率皆低于EGCG水溶液。制备得到的EGCG-β-LG纳米粒体外稳定性较EGCG水溶液有所提高,并有一定的缓释性能。

高效液相色谱-同位素稀释质谱法准确定量牛乳中β-乳球蛋白

β-乳球蛋白(β-LG)是牛乳的主要致敏蛋白之一,亟需开发一种准确且可追溯的准确定量分析方法。本研究利用胰蛋白酶酶解β-LG后,采用同位素稀释质谱(IDMS)法对特定多肽进行定量分析。同时考察氘标记特征多肽IDAL*NENK(D_(6)-Leu)及碳氮双标记特征多肽IDAL*NENK(^(13)C_(6),^(15)N-Leu)作为内标对色谱行为和检测结果的影响,并进行方法学验证。结果表明,本方法的回收率为90.1%~102.7%,变异系数(CVs)<8.0%。分析来自国内市场的5个样本,CVs<6.5%,合成成本较低的氘标记多肽在蛋白质定量中可作为^(13)C、^(15)N标记多肽的可靠替代。本方法抗干扰能力强、灵敏度高、准确度高、重现性好,有助于提高β-LG定量结果在不同实验室之间的可比性。

酪蛋白和乳球蛋白的抗体及酶标物制备研究

选用牛乳中的β-酪蛋白(β-CN)和β-乳球蛋白(β-Lg)为抗原对鸡体免疫,从鸡卵黄中用水稀释法及亲和色谱(HiTrapTM IgY Purification HP)纯化特异性鸡卵黄抗体(IgY)。PAGE电泳分析IgY纯度高达90%,ELISA效价为1:4096。用过碘酸钠氧化法进行抗原的过氧化物酶(HRP)标记,HRP与β-CN和β-Lg的分子个数比分别为1:1和1.5:1的标记效果最好,β-CN-HRP和β-Lg-HRP的效价高达1:640,其ELISA工作浓度分别为1:80和1:40。特异性IgY和酶标抗原为特异检测牛乳蛋白的酶联免疫吸附(ELISA)分析提供必要条件。

青海柴达木黄牛乳中4种乳蛋白多态性的研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对１０６头柴达木黄牛乳汁中４种乳蛋白的多态性进行了研究，结果发现：（１）αＬＡ，β－ＬＧ，αｓ１－ＣＮ和β－ＣＮ都存在多态性；（２）４种乳蛋白的平均有效等位基因数为１．３７５个，平均基因杂合度为０．２３３ ４，平均基因均质指数为０．６０７２；（３）在β－ＬＧ基因座上发现罕见等位基因 β－ＬＧＤ，在β－ＣＮ基因座上发现新等位基因在β－ＣＮＦ。

5个山羊品种β-1g5′侧翼区多态性研究

利用PCR-RFLP技术对西农萨能奶山羊、关中奶山羊、陕南白山羊、安哥拉山羊和波尔山羊等5个品种162个个体的β-lg5′侧翼区进行了多态性分析。结果表明,PCR扩增产物大小为710bp,被Sma 酶消化后表现多态性。西农萨能奶山羊、关中奶山羊、陕南白山羊、安哥拉山羊和波尔山羊的A/B等位基因频率分别为0.911/0.089,0.871/0.129,1.000/0.000,0.933/0.067,0.944/0.056,且它们的基因杂合度/有效等位基因数/Shaanon信息熵/PIC值分别为0.163/1.194/0.301/0.150,0.225/1.290/0.385/0.200,0.000/1.000/0.000/0.000,0.125/1.142/0.245/0.117,0.105/1.117/0.215/0.100。由此可见,关中奶山羊的遗传多态性最丰富,其次是西农萨能奶山羊,而安哥拉山羊和波尔山羊的遗传多态性较低,陕南白山羊未表现出多态性。

响应面法优化β-乳球蛋白粗提物自组装V_E的工艺条件

为了优化β-乳球蛋白粗提物自组装VE工艺条件,通过单因素实验研究了β-Lg粗提物与VE质量比例、磁力作用时间、热激温度对β-Lg-VE结合工艺的影响。在单因素实验基础上,利用Design Expert.V8.0.6.1软件,设计了3因素、3水平的Box-Behnken中心组合实验,进行响应面法分析,优选β-乳球蛋白粗提物自组装VE工艺条件。结果表明,β-Lg粗提物自组装VE的最佳工艺条件:β-Lg粗提物与VE质量比例为19∶1,磁力作用时间49 min,热激温度为72℃。此条件下,β-Lg-VE的结合率为(68.5±0.98)%,与理论值68.98%拟合性较好。β-Lg-VE自组装分子的溶解性较好,其在食品工业中具有广泛应用。

动态高压微射流协同糖基化处理对β-乳球蛋白热稳定性和结构的影响

采用动态高压微射流(dynamic high pressure microfluidization,DHPM)协同葡聚糖糖基化处理对β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)进行改性,研究其热稳定性和结构的变化。结果表明,β-Lg的峰顶温度为73. 48℃,经DHPM不同压力(40、80、120 MPa)处理后,其热稳定性先下降后上升,但经DHPM协同糖基化处理后,其热稳定性均呈上升趋势。理化分析结果显示,80 MPa DHPM协同糖基化处理的β-Lg具有最低的游离氨基酸含量(2. 20 mg/m L)和最高的褐变程度(A294=1. 092,A420=0. 062),说明DHPM预处理可以促进β-Lg-葡聚糖的糖基化反应,且80 MPa为最佳处理压力。结构分析表明,DHPM处理可明显提高β-Lg的表面疏水性和自由巯基含量,降低其内源荧光强度,使其发生二级结构变化。经DHPM协同糖基化处理后,β-Lg的表面疏水性有所降低,但仍高于天然β-Lg的表面疏水;自由巯基含量呈现先降低后升高趋势,在80 MPa时明显高于天然β-Lg,内源荧光强度随着压力的增加呈先降低后上升的趋势,但均明显低于天然β-Lg的内源荧光强度。因此,DHPM 80 MPa预处理样品具有最高的热稳定性和糖基化程度,且β-Lg的糖基化程度越高,其热稳定性越好。

乌兰县黄牛乳蛋白的多态性

对青海省乌兰县 74头黄牛的 4种乳蛋白的多态性进行了研究。结果发现 :①α 乳白蛋白 ,β 乳球蛋白 ,αS1 酪蛋白和 β 酪蛋白都存在多态性 ;②乌兰本地黄牛乳蛋白的多态性特征与杂种黄牛相似 ;③在乌兰本地黄牛的 β 乳球蛋白基因座上发现罕见的等位基因 β LGD。

EGCG纳米粒的制备及其抗肿瘤活性研究

采用热诱导法制备表没食子儿茶素没食子酸酯-抗坏血酸-β-乳球蛋白纳米粒(EGCG-Vc-β-Lg),考察EGCG与Vc摩尔比对纳米粒粒径、Zeta电位、包埋率、装载量、颜色变化的影响;运用噻唑蓝(MTT)比色法和胞质分裂阻滞微核试验(CBMNT)研究纳米粒对人体黑色素瘤细胞(A-375)、食管癌细胞(TE-1)的增殖抑制作用和初步作用机制。结果表明:EGCG-Vc-β-Lg对A-375、TE-1的增殖抑制有增效作用,并且显著提高了其微核率、凋亡率和坏死率。

羟基自由基氧化体系对乳清蛋白、β-乳球蛋白化学结构的影响

本实验主要研究乳清蛋白(WPI)和β-乳球蛋白(β-Lg)经过FeCl3/抗坏血酸(AsA)/H2O2产生的羟基自由基氧化系统氧化后化学结构产生的变化。两种蛋白分别经过0.1mmol/L或者1mmol/LFeCl3氧化1、5和12h后,总巯基、游离氨都下降,而羰基、二聚酪氨酸和疏水性都呈增加的趋势。低Fe3+浓度氧化1h,WPI巯基含量降低38.5%,β-Lg降低11.6%;而游离氨分别降低20.68%和0.64%。高Fe3+浓度氧化5h,WPI羰基增加32.4%,β-Lg增加8.4%;二聚酪氨酸分别增加132.4%和28%;疏水值增加161.1%和0.7%。高Fe3+浓度带来的氧化效果要比低Fe3+浓度明显(p<0.05)。这说明,氧化改变了蛋白的化学结构,氧化程度取决于浓度Fe3+的浓度,且β-乳球蛋白比乳清蛋白有更好的稳定性。

灌胃不同奶样对BALB/c小鼠致敏性的影响

本试验研究了驼奶、牛奶和人奶对BALB/c小鼠的致敏性强弱,将60只小鼠随机分为5组,每组12只,分别为β-乳球蛋白(β-lg)组(阳性对照组)、牛奶组、驼奶组、人奶组和空白组(阴性对照组),每组分别灌胃1mg/g体重的样品和0.3μg/g体重的霍乱弧菌毒素(CT),空白组灌胃PBS和CT,每周1次。灌胃6周后,通过观察过敏症状,检测血清特异性免疫球蛋白E(IgE)和IgG1、血浆组胺水平及血管通透性等指标,比较几种奶源的致敏性强弱。结果显示,驼奶组、人奶组和空白组小鼠体重正常增长,而β-lg组和牛奶组的体重增长有减慢的趋势。与空白组相比,β-lg组和牛奶组的血清特异性IgE和IgG1水平极显著升高(P<0.01),组胺水平极显著升高(P<0.01),血管通透性增加,过敏症状明显;而驼奶组小鼠血清IgE和IgG1水平极显著低于牛奶组(P<0.01),但与人奶组相比无显著差异(P>0.05),过敏症状轻微,表明驼奶的致敏性明显低于牛奶,且与人奶相似。

牛乳乳清蛋白过敏性研究进展

乳清蛋白是引起牛乳过敏的主要成分,其中,β-乳球蛋白(β-Lg)和α-乳白蛋白(α-La)是最主要的过敏原。通过蛋白质改性的方法,可以控制和消除乳清蛋白的过敏性。综述了β-Lg和α-La引起过敏的主要结构片段,并介绍了常用的降低乳清蛋白过敏性的改性方法。

水解牛乳蛋白技术及其产物的功能特性

牛乳含有丰富的蛋白质,是人类食品中重要的营养成份来源。然而与人乳相比,牛乳中酪蛋白含量比例较高,而且牛乳中的αs-酪蛋白(αs-CN)和β-乳球蛋白(β-LG)是人乳中没有的,因此以牛乳直接喂养的婴儿可能会出现消化不良和过敏症状。对牛乳蛋白进行水解的研究消除过敏引起了人们极大的关注。牛乳蛋白的水解主要是通过各种酶,此外还有化学水解(如酸水解),物理水解(如加热、高压)等方法。蛋白质水解后易产生苦味,通过控制水解度或包埋等方法可将苦味降低到不易感觉到的水平。本文还描述了牛乳蛋白水解率测定方法、牛乳蛋白水解产物分析技术,水解牛奶蛋白产物的功能特性及在婴儿配方产品及功能食品中的应用前景。

牛β-乳球蛋白胶体金免疫层析试纸条的研制及检测应用

研制了一种可快速检测羊乳及制品中牛源β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-lg)的胶体金免疫层析试纸条。通过杂交瘤技术制备牛β-lg特异性单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),利用柠檬酸钠还原氯金酸,形成30 nm胶体金颗粒,并用于标记牛β-lgmAb。采用竞争法研制免疫层析试纸条,将胶体金标记的牛β-lgmAb包被于金标垫,牛β-lg和羊抗鼠IgG标记于硝酸纤维素膜分别作为检测线(T线)和质控线(C线),牛β-lg和二抗的最佳包被浓度均为1.0 mg/mL。制得的单克隆抗体纯度都在90%以上,效价均在10000以上且特异性较好。该试纸条对牛β-lg的检测限(limit of detection,LOD)值为3.13μg/mL,对牛源α-CN,牛源β-CN,牛源κ-CN,牛源α-LA,BSA均未产生交叉反应,对脱脂羊乳粉中掺杂脱脂牛奶粉的LOD值为5%,并用该方法对市售羊奶及配方羊奶粉进行分析,检测结果与商品化的ELISA试剂盒一致。该方法前处理快速简单,可在5 min内对牛β-lg进行检测,可用于羊乳制品的现场快速检测。

人促红细胞生成素在转基因小鼠乳汁中表达

将山羊的β乳球蛋白启动子连接人促红细胞生成素基因，构建转基因表达载体。通过显微注射的方法转基因小鼠。经ＰＣＲ斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测验证，获得４只转基因阳性小鼠，其中３只母鼠哺乳期收集乳汁，经ＥｐｏＥＬＩＳＡ检测为阳性。对４组转基因阳性小鼠的部分子代母鼠，经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，又鉴定出６只获得遗传的阳性Ｇ１代母鼠以ＤｏｔＥＬＩＳＡ的方法检测，其中两只Ｇ１代母鼠乳汁中的Ｅｐｏ含量为０５μｇ／ｍＬ。实验证实，８６７ｂｐ的β乳球蛋白启动子可以指导人促红细胞生成素在小鼠乳汁中表达。

去折叠态β-乳球蛋白与表没食子儿茶素没食子酸酯的相互作用

通过微波处理β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)得到去折叠态β-乳球蛋白(unfolded-β-lactoglobulin,U-β-LG),采用荧光光谱、紫外-可见光谱、圆二色光谱的方法研究表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)与U-β-LG的相互作用机制。结果表明,EGCG能与β-LG和U-β-LG相互作用形成复合物。它们相互之间均主要为疏水作用力。在298 K时,EGCG与β-LG和U-β-LG的结合距离分别为3.188 nm和2.875 nm。EGCG的结合使β-LG和U-β-LG的二、三级结构发生变化,表面疏水性降低。与天然β-LG相比,U-β-LG与EGCG具有更大的结合强度,结合后的U-β-LG发生更大的结构变化。

β-乳球蛋白与黑米花色苷的相互作用

从荧光光谱、同步荧光光谱、紫外-可见光谱、抗氧化能力和分子对接等方面,研究黑米花色苷(black rice anthocyanin,BRA)与β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)在模拟生理条件下的相互作用。结果显示,BRA对β-LG具有较强的荧光猝灭,猝灭方式为静态猝灭,说明二者发生相互结合,同时计算了结合位点数和结合常数,热力学参数表明疏水作用力为其主要的作用力;根据非辐射能量转移理论,结合距离r为3.14 nm。同步荧光光谱结果显示,BRA与β-LG的相互作用影响乳球蛋白的构象,但不影响色氨酸和酪氨酸的微环境;分子对接结果显示BRA中的主要成分矢车菊-3-O-葡萄糖苷与β-LG的结合主要是疏水作用力,该结果与热力学参数分析结果相一致。