层理鞭枝藻藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白β亚基Cys-155的藻胆色素共价偶联

层理鞭枝藻(Mastigocladus laminosus PCC7603)藻蓝蛋白β-CPC和藻红蓝蛋白β-PEC中均存在2个藻胆色素结合位点(Cys-84和Cys-155),可与藻蓝胆素(简称PCB)发生共价偶联反应,已有研究证实编码基因为alr0617的裂合酶CpcS1是催化Cys-84与PCB共价偶联的裂合酶。在研究Cys-155与PCB共价偶联的过程中,通过BLAST软件同源性对比分析后,筛选出4个基因:cpcT1、cpcT2、cpcS1、cpcS,其中基因cpcT1和cpcS2,利用分子克隆的技术,根据实验需要转到载体pCDFDuet上,通过DNA电泳和蛋白质电泳挑选出正确的克隆。此4个基因对应的质粒与在大肠杆菌内生成PCB必需的质粒pACYCDuet-ho1-pcyA,以及质粒pET-cpcB(C84S)或pET-pecB(C84A),共同转入大肠杆菌BL21(DE3)内,进行体内重组,得到各重组蛋白,经过亲和层析柱提纯并透析,过滤掉金属离子,纯化透析后的蛋白经过活性比较、蛋白质电泳以及锌染色、蛋白质变性等试验以及荧光和紫外吸收光谱等鉴定,通过与相应文献中PCB光谱的比对,确定编码基因为all5339的裂合酶CpcT1能高效地催化Cys-155与PCB共价偶联,而其余3个基因不能起到催化作用。由此,能催化脱辅基蛋白β-CPC和β-PEC的两个位点共价偶联PCB的裂合酶均被发现。实验对于研究藻胆蛋白的生物合成、光合作用捕光机理以及藻胆体的组装等有重要的意义。

藻红蓝蛋白β亚基体内重组及其色谱分析

藻胆蛋白是蓝藻中的捕光蛋白,其生物合成的重要一步是藻胆色素与脱辅基蛋白的连接。大多数藻胆色素的正确连接都需要结合位点专一和对色素的构象有选择性的裂合酶来催化完成,但是这方面的报道不是很多。藻红蓝蛋白由两个亚基组成,β亚基(简称β-PEC)含171个氨基酸残基及两个辅基色素藻蓝胆素(简称PCB),分别在Cys-84和Cys-155位以硫醚键共价相连。通过同源性分析获得的由编号为alr0617基因编码的蛋白为藻红蓝蛋白β亚基(β-PEC)中的Cys-84与PCB的连接的催化酶。为了研究层理鞭枝藻藻红蓝蛋白(PEC)β亚基(β-PEC)中藻蓝胆素(PCB)与脱辅基蛋白的连接机制,通过体内重组方式得到色素蛋白PCB-PecB(C155I),分析表明该色素蛋白与β-PEC的吸收光谱和荧光光谱一致。酸性尿素变性实验证明得到的色素蛋白中的藻蓝胆素PCB没有被破坏。使用胃蛋白酶对天然藻红蓝色素蛋白和重组藻红蓝色素蛋白进行相同条件的水解并得到各自的色素肽,高效液相色谱分析表明这两种色素肽相同,由此证明了编号为alr0617基因编码的蛋白质能催化PCB与PecB(C155I)正确共价偶联。

β微管蛋白Ⅲ基因在乳腺癌组织中表达及与化疗疗效的关系

目的探讨乳腺癌组织中β微管蛋白Ⅲ(β-tubulin isotypeⅢ,TUBB3)mRNA表达与化疗效果的关系。方法 89例乳腺癌患者,采用DNA液相芯片技术检测手术切除乳腺癌组织中TUBB3 mRNA表达水平,并依据TUBB3mRNA表达水平分为高表达组和中低表达组;术后采用PAC(多西他赛+吡柔比星+异环磷酰胺)或PEC(紫杉醇+表柔比星+环磷酰胺)方案化疗,每21d为1个周期,化疗结束评价疗效;分析TUBB3 mRNA表达与临床病理特征的关系,比较高表达组和中低表达组化疗效果,非条件logistic回归分析影响化疗效果的因素。结果 89例中TUBB3 mRNA高表达49例(55.06%),低表达18例(20.22%),中表达22例(24.72%);TUBB3mRNA表达在年龄,是否绝经以及雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体2是否阳性上差异均无统计学意义(P>0.05),在是否发生淋巴结转移、组织学分级上差异有统计学意义(P<0.05);89例中26例完成3个周期化疗,63例完成4个周期化疗,总有效率为26.97%;高表达组总有效率(14.29%)低于中低表达组(42.50%)(P<0.05);非条件logistic回归分析结果显示,TUBB3 mRNA高表达(OR=1.729,95%CI:1.339~5.528,P=0.049)、组织学低分级(OR=1.618,95%CI:1.201~4.285,P=0.023)、淋巴结发生转移(OR=1.263,95%CI:1.098~2.796,P=0.047)是影响化疗效果的因素。结论乳腺癌化疗效果与乳腺癌组织TUBB3高表达有关。