基于Notch与Wnt/β-catenin通路探讨黄芪甲苷对人成纤维细胞间质转化的作用

目的基于Notch与Wnt/β-catenin通路,探讨黄芪甲苷(astragalosideⅣ,AS-Ⅳ)对类风湿关节炎相关间质性肺病(rheumatoid arthritis associated interstitial lung disease,RA-ILD)体外模型的作用机制。方法用Luminex检测法对RA-ILD模型鼠支气管肺泡灌洗液中细胞因子进行检测,筛选出关键细胞因子;共培养人髓系白血病单核细胞(human myeloid leukemia mononuclear cells,THP-1)与正常人肺成纤维细胞(normal human lung fibroblast,NHLF)两种细胞系,加入关键细胞因子模拟RA-ILD体外模型,给予不同干预措施。通过RT-PCR、Western blot、COIP、EdU、ELISA以及双荧光素酶报告基因活性检测方法观察Snail、ZEB-1及E-Cadherin的启动子活性及mRNA表达、Notch通路中的关键蛋白表达、β-catenin的核转位水平、NHLF细胞增殖速率、ColⅠ、ColⅢ及Fibronectin的分泌水平以及β-catenin与NICD、β-catenin与LEF、NICD与CSL的相互作用。结果使用细胞因子处理NHLF细胞后,Snail、ZEB-1的启动子活性及mRNA表达明显增高,Notch通路中的关键蛋白表达水平显著上调,β-catenin的核转位明显增加,EdU阳性细胞明显增加;细胞上清中ColⅠ、ColⅢ及Fibronectin分泌水平显著上调,同时β-catenin与NICD、β-catenin与LEF、NICD与CSL的蛋白结合明显增加;使用Notch抑制剂DAPT和Jagged1 shRNA时结果与上述结论相反;AS-Ⅳ能够通过抑制Jagged1进而下调Notch及β-catenin信号通路的过度活化,抑制β-catenin与NICD、β-catenin与LEF、NICD与CSL的蛋白结合,能够剂量依赖性地抑制Snail及ZEB-1并上调E-Cadherin的启动子活性、mRNA和蛋白表达水平,抑制NHLF细胞的过度增殖及Col I、ColⅢ、Fibronectin的分泌。结论AS-Ⅳ可能通过抑制Notch和Wnt/β-catenin信号通路,抑制NHLF细胞增殖,减少ECM过度沉积,从而减缓RA-ILD肺间质纤维化进展。

基于Wnt/β-catenin通路探讨拔毒生肌散对糖尿病大鼠皮肤溃疡愈合的促进作用

目的探讨拔毒生肌散通过调控Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路对糖尿病大鼠皮肤溃疡愈合的促进作用。方法随机将60只Wistar雄性大鼠分为正常对照组和糖尿病组。采用腹腔注射链脲佐菌素结合喂食高脂高糖饲料方法制备糖尿病模型。28 d后,对比正常对照组和糖尿病组大鼠的体质量和血糖,然后制备背部皮肤溃疡模型。造模成功的糖尿病大鼠分为模型组、拔毒生肌散组、一效膏组、清创胶组。各组用药14 d。在第7、14天,采用Image-pro plus 6.0软件测量各组大鼠创面愈合率,采用苏木素-伊红(HE)染色法检测肉芽组织病理变化,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测肉芽组织晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)、晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end-products,RAGE)、Wnt1、β-catenin、糖原合成酶激-3β(glycogen synthase exciter-3β,GSK-3β)蛋白含量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肉芽组织RAGE、Wnt、β-catenin、GSK-3βmRNA表达水平。结果与正常对照组比较,糖尿病组大鼠的体质量下降(P<0.01),血糖升高(P<0.01)。与正常对照组比较,模型组第7、14天创面愈合率均较低(P<0.01);肉芽组织中炎症细胞较多,成纤维细胞、胶原纤维和毛细血管数量较少;肉芽组织Wnt1、β-catenin mRNA表达水平较低(P<0.01),AGEs蛋白、RAGE、GSK-3β蛋白和mRNA含量较高(P<0.01)。与模型组比较,拔毒生肌散组第7、14天创面愈合率较高(P<0.01);肉芽组织AGEs蛋白、RAGE、GSK-3β蛋白和mRNA含量较低(P<0.05,P<0.01),Wnt1、β-catenin mRNA表达水平较高(P<0.01)。结论拔毒生肌散通过调节Wnt/β-catenin通路促进糖尿病大鼠皮肤溃疡的愈合。AGEs的沉积导致Wnt/β-catenin通路的抑制。

木犀草素通过GSK-3β/β-catenin通路抑制胶质母细胞瘤细胞侵袭、迁移及上皮间质转化

目的:研究木犀草素对人胶质瘤U87及U251细胞侵袭、迁移能力的影响及其机制。方法:体外培养胶质瘤U87及U251细胞系,将对数生长期细胞随机分为对照组及木犀草素处理组,利用CCK-8实验检测细胞活力,划痕实验及Transwell实验检测胶质瘤细胞迁移侵袭能力,Western blot实验及免疫荧光实验检测木犀草素对胶质瘤细胞上皮间质转化相关蛋白及GSK-3β/β-catenin信号通路的影响;使用GSK-3β/β-catenin信号通路抑制剂(G?6983)或激动剂(LiCl)处理U87及U251细胞验证木犀草素对U87及U251细胞相关蛋白表达及侵袭迁移能力的影响。裸鼠成瘤实验探究木犀草素对裸鼠体内瘤体的瘤重、瘤体积的影响。结果:木犀草素以时间浓度依赖性抑制胶质瘤U87及U251细胞活性。划痕实验及Transwell实验显示,木犀草素处理组较对照组细胞侵袭迁移能力降低(P<0.05)。木犀草素处理使胶质瘤细胞由间充质形态向上皮细胞形态转变。与对照组相比,木犀草素组N-cadherin、Vimentin、β-catenin(胞浆、胞核)、p-GSK-3β(Ser9)等蛋白水平降低,而E-cadherin蛋白水平上升(P<0.05)。GO6983处理可加强木犀草素对上皮间质转化及GSK-3β/β-catenin信号通路的影响;LiCl处理可逆转木犀草素对上皮间质转化、GSK-3β/β-catenin信号通路及侵袭迁移能力的影响。体内实验显示,木犀草素治疗组瘤体体积、瘤体质量较对照组降低(P<0.05)。结论:木犀草素可以抑制胶质瘤U87及U251细胞侵袭和迁移,其机制可能是通过调节GSK-3β/β-catenin信号通路而抑制EMT过程。

小檗碱抑制HCT116细胞生长与Wnt/β-catenin信号的关系研究

目的研究小檗碱对结肠癌细胞的增殖抑制作用与Wnt/β-catenin信号的关系。方法结晶紫染色法检测小檗碱对HCT116细胞增殖的抑制作用,采用流式分析及West-ern blot研究小檗碱诱导HCT116细胞凋亡;Western blot检测β-catenin蛋白表达、RT-PCR法检测β-catenin mRNA表达,确定小檗碱对其表达的影响;采用外源性过表达β-cate-nin研究小檗碱抑制HCT116细胞增殖与β-catenin的关系。结果小檗碱处理组细胞较对照组细胞增殖明显受到抑制,并诱导HCT116细胞凋亡。小檗碱处理组全细胞、胞质及核内β-catenin蛋白水平均明显较对照组低。外源性过表达β-catenin能减弱小檗碱对HCT116细胞增殖的抑制作用。小檗碱处理组β-catenin mRNA表达明显受到抑制。结论小檗碱能抑制HCT116细胞增殖并抑制Wnt/β-catenin信号转导,其机制可能与下调β-catenin mRNA表达有关。

β-榄香烯通过抑制WNT信号通路促进MG-63细胞凋亡

β-榄香烯在作为化疗药使用时表现为毒副作用小,极少产生耐药性[1]。但是榄香烯治疗骨肉瘤尚未见报道。我们应用榄香烯作用于人骨肉瘤细胞系MG-63细胞,观察其对细胞增殖和凋亡的影响,并进一步研究Wnt/β-catenin信号传导通路在其中的作用。

二烯丙基二硫下调TGF-β1/Rac1通路抑制人胃癌细胞β-catenin表达

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)是否通过下调TGF-β1/Rac1通路抑制人胃癌MGC803细胞β-catenin表达。方法实验组分为6组,对照组(Control),DADS处理组,TGF-β1处理组,TGF-β1+SB431542组,TGF-β1+DADS组,TGF-β1+NSC23766组。RT-PCR、Western blot分别检测TGF-β1、Rac1、β-catenin、E-cadherin和vimentin mRNA和蛋白水平。结果DADS下调TGF-β1、Rac1、β-catenin和vimentin,上调E-cadherin表达。TGF-β1受体阻断剂SB431542和Rac1抑制剂NSC23766下调β-catenin和vi-mentin,上调E-cadherin表达。结论DADS通过下调TGF-β1/Rac1通路抑制人胃癌MGC803细胞β-catenin表达。

姜黄素靶向抑制SW480细胞信号通路研究

目的:探讨姜黄素抑制SW480细胞的作用机制。方法:应用内盐法(MTS)检测方法观察SW480细胞活性及姜黄素的干预影响;应用Western blot、实时定量PCR研究姜黄素对SW480细胞的信号干预机制,检测上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β-链蛋白(β-catenin)、T细胞转录因子4(TCF4)基因等表达量。结果:SW480细胞增殖活性在姜黄素干预下被明显抑制,姜黄素对SW480细胞增殖IC50分别为(75.75±3.17)μmol/L(12 h)、(21.15±2.47)μmol/L(24 h)、(18.95±1.75)μmol/L(48 h)、(17.93±1.55)μmol/L(72 h);姜黄素干预下,SW480细胞内E-cadherin、Vimentin明显上调,而β-catenin、TCF4明显下调,且呈剂量依赖性。结论:姜黄素能抑制SW480细胞活性,并通过Wnt/β-catenin信号通路发挥靶向抑制作用。

胸腺瘤中E-cadherin、β-catenin蛋白和基因的表达

目的探讨E-cadherin、β-catenin蛋白和基因的表达与胸腺瘤侵袭性的相关性。方法收集2012年~2016年东莞市人民医院存档的胸腺瘤手术标本120例,参照胸腺瘤镜下表现、Masaoka临床分期标准、临床表现及影像资料将其分为无侵袭性和有侵袭性两组,并对两组分别行E-cadherin和β-catenin抗体免疫组化染色及E-cadherin和β-catenin基因荧光原位杂交实验。结果有侵袭性胸腺瘤55例,无侵袭性胸腺瘤65例,E-cadherin和β-catenin蛋白在无侵袭性和有侵袭性胸腺瘤中的表达差异有统计学意义(P<0.05)。在无侵袭性和有侵袭性胸腺瘤中,E-cadherin基因表达缺失和β-catenin基因表达扩增组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论应用免疫组化检测E-cadherin和β-catenin蛋白及荧光原位杂交技术检测E-cadherin和β-catenin基因,有助于无侵袭性和有侵袭性胸腺瘤的鉴别。

骨质疏松肾阳虚和肾阴虚证型下左归丸含药血清干预成骨细胞ERK1/2,Wnt/β-catenin信号通路的研究

该文研究骨质疏松(OP)肾阳虚和肾阴虚证型下左归丸含药血清对成骨细胞增殖和碱性磷酸酶(ALP)表达及对成骨细胞ERK1/2,Wnt/β-catenin信号通路相关因子β-catenin,ERK1,ERK2 mRNA及蛋白表达的作用。采用手术去卵巢法造成大鼠骨质疏松模型,并在手术10周后,分别注射氢化可的松、灌胃甲状腺素造成大鼠OP肾阳虚及OP肾阴虚模型;用新生24h乳鼠颅骨体外培养得成骨细胞,以碱性磷酸酶和茜素红染色进行鉴定,分别用OP肾阳虚、OP肾阴虚及OP组(对照组)所得的左归丸含药血清、空白血清干预成骨细胞,采用MTS法检测细胞增殖情况,ELISA法检测ALP表达,RT-PCR法检测ERK1/2,β-catenin mRNA的表达,Western blot法检测ERK1/2,β-catenin蛋白表达。结果表明:OP肾阴虚证型下左归丸含药血清在促进成骨细胞增殖、ALP表达、成骨细胞ERK1/2,Wnt/β-catenin信号通路相关因子β-catenin,ERK1,ERK2 mRNA及蛋白表达方面比OP肾阳虚证型下左归丸含药血清的作用更强。这与"左归丸滋肾阴"的中医理论相吻合,为临床辩证治疗骨质疏松症提供科学依据。左归丸通过ERK1/2和Wnt/β-catenin信号通路调控成骨细胞的增殖与分化,可能是左归丸防治骨质疏松肾阴虚证的机制之一。