红霉素对支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的影响

目的:探讨红霉素对支气管上皮细胞16-HBE谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和谷胱甘肽(GSH)的影响。方法:应用红霉素5μg/ml分别孵育细胞16-HBE细胞2 h,8 h,16 h,24 h。分别应用显色法,Western blot和荧光定量PCR方法检测细胞内GSH,γ-GCS重链蛋白和mRNA的表达。结果:经红霉素孵育后,16、24 h后,细胞内GSH、γ-GCS重链蛋白和mRNA的表达较对照组增加。结论:红霉素对支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和GSH的合成有上调作用。

PI3K/Akt-aPKC_(ι/ζ)-Nrf2调控大鼠气道上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达

目的:观察香烟烟雾提取物(CSE)是否通过磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt-不典型蛋白激酶Cι/ζ(aP-KCι/ζ)-核因子相关因子2(Nrf2)信号通路调控大鼠气道上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(-γGCS)表达。方法:用Western blot法检测-γGCS、Nrf2、p-Akt和p-aPKCι/ζ蛋白质,细胞免疫化学法观察-γGCS蛋白质表达,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测-γGCSmRNA,免疫荧光法检测Nrf2蛋白质,流式分析法检测p-Akt阳性细胞率,双酶法测定-γGCS活性,酶循环分析法测定总还原型谷胱甘肽(GSH)含量。结果:暴露CSE 3 h,GSH含量显著升高,Nrf2胞核蛋白质、p-aPKCι/ζ蛋白质、p-Akt蛋白质及其阳性细胞率、-γGCS蛋白质及其mRNA和活性均显著增强。aPKCι/ζ抑制剂RO813220明显减弱p-aPKCι/ζ蛋白质、-γGCS蛋白质及其mRNA和活性表达,但增强Nrf2胞浆蛋白质表达,对p-Akt无影响。p-Akt抑制剂LY294002及RO813220+LY294002均降低p-aPKCι/ζ蛋白质、p-Akt蛋白质及阳性细胞率、-γGCS蛋白质及其mRNA和活性表达,增强Nrf2胞浆蛋白质表达。直线相关性分析显示Nrf2与-γGCS、p-Akt及p-aPKCι/ζ呈正相关,p-Akt与Nrf2、p-aPKCι/ζ及-γGCS呈正相关,p-aPKCι/ζ与Nrf2、p-Akt及-γGCS呈正相关(P<0.05)。结论:CSE可能通过PI3K/Akt-aPKCι/-ζNrf2调节-γGCS表达。

溴氰菊酯对γ-GCS活力和谷胱甘肽含量影响

目的探讨溴氰菊酯(DM)对PC12细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)活力和谷胱甘肽(GSH)含量的影响。方法用0、1、10、100μmol/L DM处理PC12细胞6或12 h后用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测细胞毒性;用0、10、100μmol/L DM处理PC12细胞6或12 h后,超速离心分离细胞胞质碎片,邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生高效液相色谱(HPLC)荧光法检测组织中γ-GCS酶活力和GSH含量。结果 100μmol/L DM处理细胞6、12 h的细胞存活率为(0.862±0.053)、(0.746±0.101),均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.001);与对照组γ-GCS酶活力(1.78±0.26)pmol/106细胞.min比较,10、100μmol/L DM处理细胞6 h组γ-GCS酶活力为(1.66±0.20)、(1.73±0.09)pmol/106细胞.min,差异均无统计学意义;与对照组GSH含量(10.18±0.23)pmol/106细胞比较,10、100μmol/L DM处理细胞6 h GSH含量为(10.19±1.18)、(10.26±0.29)pmol/106细胞,差异均无统计学意义;与对照组γ-GCS酶活力(1.94±0.19)pmol/106细胞.min和GSH含量(9.57±0.39)pmol/106细胞比较,10μmol/L DM处理细胞12 h组γ-GCS酶活力(1.73±0.21)pmol/106细胞.min和GSH含量(9.72±0.41)pmol/106细胞差异均无统计学意义,100μmol/L DM处理细胞12 h组γ-GCS酶活力(1.62±0.09)pmol/106细胞.min差异有统计学意义(P=0.006)。结论较高浓度的DM处理细胞较长时间才抑制γ-GCS酶活力,可能与DM的细胞毒性作用有关。

锰对小鼠黑质GSH合成相关酶γ-GCS和GSS的影响

目的探讨锰对小鼠黑质GSH（glutathione）合成相关酶γ-GCS（γ-glutamylcysteine synthetase）和GSS（glutathione synthetase）的影响,为锰中毒机制的研究提供依据。方法小鼠64只,雌雄各半,依体重随机分为4组,每组16只,第1组为对照组,第2~4组分别为低、中、高剂量染锰组。第1组腹腔注射0.9%氯化钠,第2~4组分别腹腔注射12.5、25、50 mg/kg Mn Cl2,注射剂量为5 ml/kg,每天染毒1次,持续2周。最后一次染毒24 h后,将小鼠用水合氯醛麻醉后快速处死,冰浴条件下分离脑组织并取黑质;HE染色和透射电镜观察黑质组织形态及超微结构,Neu N和GFAP荧光双染观察神经元和星形胶质细胞分布及数量变化,试剂盒检测黑质内GSH含量,Western blotting法检测γ-GCS和GSS蛋白水平。结果随着各组染锰浓度升高,黑质组织形态和超微结构损伤逐渐加剧;免疫荧光发现胶质细胞增多,神经元减少;黑质内GSH水平下降,中剂量染锰组下降了53.82%,高剂量染锰组下降了68.36%;γ-GCS和GSS蛋白表达水平下降,其中γ-GCS在中、高剂量染锰组分别下降了7.8%、28.9%,GSS在中、高剂量染锰组分别下降了12.94%、32.94%。结论锰可通过干扰GSH合成相关酶γ-GCS和GSS的表达,影响GSH的合成,产生神经毒性。

GSH在COPD大鼠肺内合成机制和作用的研究

目的探讨还原型谷胱甘肽(GSH)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)肺内合成的分子机制及其作用。方法健康雄性Wistar大鼠14只,随机分COPD模型组和对照组,每组7只。采用每日熏香烟和两次气管内滴入200μg脂多糖法制作COPD大鼠模型,检测肺内GSH和活性氧(ROS)浓度、总抗氧化力水平(T-AOC)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)活性;对相关指标作相关分析。结果COPD组大鼠肺内GSH(35.86±6.01)mg/mg.prot和ROS(30.45±5.23)U/mg.prot增高,T-AOC(0.69±0.10)U/mg.prot降低,γ-GCS活性(2.06±0.15)U增高,与对照组分别为(16.50±2.43)mg/mg.prot、(9.84±2.16)U/mg.prot、(1.59±0.57)U/mg.prot和(1.12±0.09)U相比差异具有显著性(P均<0.05);GSH、ROS、γ-GCS活性与PEF、FVE0.3、PaO2呈直线负相关,与PaCO2呈直线正相关;T-AOC与PEF,FVE0.3呈直线正相关(P均<0.05)。结论COPD大鼠肺内存在氧化/抗氧化失衡,其局部抗氧化作用是通过激活γ-GCS活性,增加GSH合成来发挥局部抗氧化作用,其气道阻力增加可能与肺内局部氧化/抗氧化失衡有关。

溴氰菊酯及6-羟基多巴胺对PC12细胞Nrf2/ARE通路影响

目的探讨溴氰菊酯(DM)与6-羟基多巴胺(6-OHDA)对转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)通路作用的影响及差异。方法用10μmol/L溴氰菊酯处理PC12细胞1h或用100μmol/L6-OHDA处理PC12细胞17h后,用RT-PCR方法检测细胞Nrf2基因和其驱动的靶基因-γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS,由重亚单位GCSh和轻亚单位GCS1组成)和血红素氧合酶(HO-1)基因 mRNA表达水平,蛋白印迹(Westernblot)方法检测细胞Nrf2蛋白水平,免疫荧光细胞化学技术检测细胞HO-1蛋白水平。结果 DM染毒诱导转录因子Nrf2 mRNA表达、激活Nrf2,Nrf2可能参与DM对Nrf2下游基因GCSh、GCS1以及HO-1表达的调控;6-OHDA能诱导PC12细胞Nrf2 mRNA和蛋白的表达以及激活Nrf2;6-OHDA也诱导细胞HO-1或GCSh mRNA和蛋白的表达。结论 DM与6-OHDA对Nrf2/ARE通路的作用相似,DM是可干扰Nrf2/ARE通路的神经毒物。

白藜芦醇对慢性铅暴露小鼠脑组织Nrf2信号通路的影响

目的研究白藜芦醇干预对慢性铅暴露小鼠脑组织氧化应激进程中核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路的影响。方法 48只健康C57BL/6雄性小鼠随机分为4组,每组12只:对照组、铅染毒组、铅染毒+白藜芦醇干预组及白藜芦醇组。铅染毒模型组小鼠给予自由饮用0.2%醋酸铅去离子水12周。期间干预组及白藜芦醇组小鼠每日给予白藜芦醇灌胃干预(50 mg/kg BW)。收集小鼠血清及全脑并测定其血清和海马组织中铅含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)含量,通过Western blot方法检测γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、Nrf2总蛋白以及Nrf2核蛋白的表达。结果与单纯铅染毒组比较,白藜芦醇干预组小鼠脑组织MDA含量降低(P<0.05),GSH-Px活性以及GSH含量均显著升高(P<0.05),同时Nrf2以及下游基因γ-GCS的蛋白表达水平均显著提高(P<0.05)。结论白藜芦醇干预可诱导铅暴露小鼠大脑皮层Nrf2蛋白活化,上调细胞保护性γ-GCS蛋白的表达,促进GSH系统维持稳态,从而拮抗铅对脑组织的氧化损伤。