淡紫拟青霉γ-actin基因cDNA全长的克隆与序列分析

利用同源克隆的策略对淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)γ-actin基因进行克隆,获得了淡紫拟青霉γ-ac-tin基因cDNA全长。该基因cDNA的ORF长1128bp,编码375个氨基酸,具有actin基因的保守特征序列。由该基因推导的氨基酸序列与多个子囊菌的γ-actin蛋白序列相似性达98%以上。系统进化树显示其系统发育关系与传统的分类关系基本一致。

中华大蟾蜍γ-肌动蛋白基因Bbgγ-Actin的克隆与生物信息学分析

旨在获得中华大蟾蜍肌动蛋白序列全长。以中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)耳后腺为材料,提取总RNA,通过转录组高通量测序快速得到中华大蟾蜍肌动蛋白基因(Bbg Actin)cDNA全长2 055 bp,通过RT-PCR技术对其ORF序列进行验证,并对Bbg Actin基因进行分析。序列分析表明,Bbg Actin基因开放阅读框长1 131 bp,编码376个氨基酸。通过BLAST P程序分析,所得序列与Gen Bank数据库中肌动蛋白基因序列相似度均在89%以上,氨基酸序列的相似性达90%以上。系统进化分析表明,Bbg Actin与γ-Actin聚为一类,所得中华大蟾蜍肌动蛋白属于γ-Actin。首次获得了中华大蟾蜍γ-Actin cDNA全长序列。

PPARγ和α-SMA在单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中的表达及其意义

目的观察单侧输尿管梗阻(UUO)模型大鼠肾组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)表达变化及其与肾小管间质纤维化间的关系.方法 36只SD大鼠随机分为假手术组(n=6)和模型组(n=30).模型组行UUO术,并随机分为3、7、14、21和28 d组.相应时间点活杀动物,取肾脏,用常规苏木素-伊红(HE)、Masson、高碘酸-乌洛托品银(PASM)染色,观察肾小管病变程度;用免疫组化法测定UUO大鼠梗阻肾不同时间点α-SMA和PPARγ表达变化及与肾脏病理变化间的关系.结果病理学结果显示,UUO 3和7 d时肾小管上皮细胞肿胀,炎症细胞浸润,纤维组织增生尚不明显;14 d和21 d时肾皮质大量炎症细胞浸润及纤维组织增生;28 d时表现为肾小管严重破坏,纤维组织弥漫增生.免疫组化结果显示,PPARγ在假手术组肾组织中几乎无表达;UUO模型大鼠随着病变进展,肾组织PPARγ表达增加,主要分布在肾小管上皮细胞、浸润的单核细胞,3 d时表达量开始增加,14 d达高峰,此后表达略有减少,但仍显著高于假手术组及3 d和7 d组.假手术组α-SMA仅表达于血管平滑肌肌层,3 d时肾间质出现表达,14～21 d表达显著增加,阳性信号弥漫分布,高峰持续至28 d实验结束.结论 PPARγ在UUO大鼠显著升高, 其表达与α-SMA的表达量及肾小管间质病变程度早期一致,14 d达峰值后表达不再随病变加重而进一步升高.UUO病变早期PPARγ反应性升高可能在肾脏局部炎症和纤维化病程中发挥了重要作用.

柔嫩艾美耳球虫免疫期间鸡盲肠扁桃体γ干扰素表达动态的检测

根据GenBank鸡β-actin、IFN-γ的基因序列设计引物,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆获得β-actin和IFN-γ基因,采用β-actin为内参的半定量方法检测IFN-γ mRNA在鸡柔嫩艾美耳球虫免疫前后不同时间的表达情况,以探讨IFN-γ的表达动态与柔嫩艾美耳球虫免疫的关系。结果显示,IFN-γ在两次免疫期间的表达量整体上呈现双峰模式,首免后第7天达到一个高峰,二免后第7天达到另一个高峰。

γ-干扰素对兔胆总管愈合过程中α-平滑肌动蛋白表达的影响

目的观察γ-干扰素(IFN-γ)对胆总管损伤愈合过程中α-平滑肌动蛋白(-αSMA)表达的影响,为临床防治胆管狭窄寻求一条新的途径。方法制作兔肝外胆管损伤修复模型16只,随机分为实验组和对照组各8只,实验组每天肌注IFN-γ10万IU/kg,对照组肌注等量生理盐水,8周后处死动物,取材,行HE染色和-αSMA免疫组化染色,图像分析仪定量分析。结果实验组-αSMA单位面积分光密度均与对照组有显著性差异。结论γ-干扰素通过抑制-αSMA的表达,抑制胆道挛缩,减轻胆总管愈合过程中的胆道狭窄。

γ射线致小鼠血液β-肌动蛋白、凝血和炎性因子改变的观察

通过观察γ射线诱导的小鼠血液β-肌动蛋白(β-actin)、凝血因子和IL-8表达改变的时相关联性,了解β-actin在急性放射损伤中的作用。BALB/C小鼠经60Coγ射线6Gy剂量照射(剂量率0.81Gy/min),收集照后立即及照后第1、2、3、4、7和14d小鼠外周血及脾脏。磁珠分离酶联免疫法检测外周血β-actin含量;STAGO血液凝集仪检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)和血浆纤维蛋白原(FIB)三项凝血指标;Realtime-PCR检测白细胞介素8(IL-8)DNA表达。结果发现,小鼠经6Gy辐照后血浆β-actin立即升高,并于照后1d达峰值,随后直至照后第4d快速下降,照后4―14d下降速度趋缓,但血浆β-actin量仍显著高于对照。照后不同时间PT、APTT、FIB和IL-8的变化趋势与β-actin类似。其中,FIB上升达到峰值及下降的时相过程与β-actin基本一致。从照后第4d起FIB下降直至低于正常对照水平,而PT、APTT和IL-8DNA表达约在照后2―3d升至峰值,然后下降,但PT和APTT值仍高于未照射对照,而IL-8DNA表达则可下降至未照射对照水平。受照小鼠血中凝血指标PT、APTT、FIB,炎性指标IL-8和β-actin均发生相似时相变化。结果提示,辐照后血中β-actin的量和量变的时间动力学过程研究,对于了解电离辐射诱导机体损伤的新病理因素有积极意义。

激活巨噬细胞的肌动蛋白分布和钙离子水平

目的 研究被LPS和IFN γ激活的巨噬细胞的肌动蛋白分布和钙离子水平 ,探讨肌动蛋白构成和钙离子浓度在巨噬细胞游走和吞噬方面的作用。 方法 LPS和IFN γ激活大鼠巨噬细胞后 ,用phallacidin和Fura 2标记肌动蛋白和游离钙离子 ,共聚焦激光扫描显微镜和钙离子图像分析仪下观察肌动蛋白分布和分析钙离子水平。 结果 在被激活的巨噬细胞 ,游走细胞和吞噬细胞的数量增加。细胞内F 肌动蛋白增多 ,钙离子水平升高。游走细胞有头部和尾部 ,头部伸出板状伪足和丝状伪足。板状伪足和丝状伪足内含有丰富的F 肌动蛋白。细胞底部出现肌动蛋白丝构成的应力纤维。在游走细胞 ,尾部的钙离子水平比头部高。游走细胞转向时 ,弯曲部的钙离子水平明显升高 ,特别是弯曲部的外侧区。巨噬细胞吞噬淋巴细胞时 ,吞噬处的钙离子水平显著升高。 结论 巨噬细胞被LPS和IFN γ激活时 ,游走和吞噬功能明显增强 ,细胞内F

PPARγ激动剂对成人正常皮肤成纤维细胞转分化的作用

目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导成纤维细胞转分化的影响,探讨其抗瘢痕纤维化的潜在作用。方法:体外培养成人正常皮肤成纤维细胞,利用免疫荧光细胞化学法观察、分析PPARγ配体15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)及其激动剂曲格列酮对TGF-β1诱导的α平滑肌动蛋白(α-SMA)表达的影响,利用Western blot、实时荧光RT-PCR技术检测PPARγ激动剂对TGF-β1诱导的α-SMA蛋白及mRNA水平的影响。结果:TGF-β1能显著增加成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞;与TGF-β1诱导组相比,10μM曲格列酮、15d-PGJ2预处理组的α-SMA表达量显著减少(P<0.01),抑制效应分别为31%、57%;预处理组的α-SMA mRNA水平显著下降(P<0.01)。结论:PPARγ激动剂能抑制TGF-β1诱导的成人正常皮肤成纤维细胞的转分化的效应,具有抗皮肤瘢痕化、挛缩的潜在作用。

γ-氨基丁酸B受体在CCl_4诱导肝纤维化大鼠中的表达

目的:探讨γ-氨基丁酸(GABA)B受体在肝纤维化大鼠中的表达.方法:SD大鼠,腹腔注射50%CCl4制备大鼠肝纤维化模型.从第6周开始,每周1次取大鼠肝组织,得到不同肝纤维化程度的肝脏标本.一部分标本40g/L甲醛固定,常规石蜡包埋,连续4μm切片,做组织病理学染色(HE、Masson)和免疫组织化学(α-SMA),以确定不同肝纤维化水平.另一部分标本-80℃保存用于提取肝脏RNA,逆转录得到cDNA,设计GABA(B)受体、α-SMA、TGF-β、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ的引物,做实时荧光定量PCR,分析GABA(B)受体的表达与大鼠肝纤维化程度的相关性.结果:建模7wk时,α-SMA、TGF-β、胶原Ⅰ和胶原Ⅲ较6wk分别增加19.2倍、2.1倍、37.5倍和183.5倍.GABA(B)受体基因表达也明显升高,升高量达到116.2倍.6wk对照组GABA(B)受体基因表达是模型组的2倍.到12wk初步形成假小叶时,只有α-SMA和胶原Ⅰ增加显著,分别为21.6倍和20.1倍.TGF-β和胶原Ⅲ变化不明显.其他时间点基因表达与6wk模型相比无明显变化.结论:GABA(B)受体可能参与了肝纤维化的发生.在肝纤维化晚期,细胞外基质的合成主要以胶原Ⅰ为主,胶原Ⅲ次之.α-SMA的表达与肝纤维化水平呈正相关.

肺动脉高压病因学最新研究进展

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一组少见的、预后不良的疾病,以进行性增高的肺动脉压力和阻力为特征。其病理变化包括肺血管收缩与重构、肺血管平滑肌和内皮细胞的异常增殖、血栓形成等。PAH的发病机制复杂,最新研究表明肺动脉高压病因包括骨形成蛋白Ⅱ型受体(BMPR2)和活化素受体样激酶(ALK1)等遗传基因变异以及过氧化物酶增殖物激活受体(PPAR)、Rho激酶信号通路等的异常。这为肺动脉高压的治疗和预防提供了更多的理论依据。

干扰素-γ对人结膜下Tenon’s囊成纤维细胞表型转化的干预

目的探讨干扰素-γ(IFN-γ)对人结膜Tenon s囊成纤维细胞(HTCF)表型转化的干预作用。方法4例白内障手术中,取结膜下组织块培养成纤维细胞。用蛋白质印迹免疫检测技术和免疫细胞化学技术鉴定细胞表型。检测未经诱导及经转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导(有或无IFN-γ预处理)后的HTCF表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的情况。结果与未经诱导的HTCF相比较,10ng/mL的IFN-γ能显著抑制HTCF转化为肌成纤维细胞(MF)(P<0.01)。对于经过IFN-γ预处理后再用TGF-β1诱导的HTCF,IFN-γ仅能部分抑制其表达α-SMA。结论IFN-γ能抑制HTCF转化为MF;仅能部分干预TGF-β1诱导HTCF转化为MF的作用。

化纤方通过上调外周及组织IFN-γ水平缓解放射性肺纤维化

目的:探究中药化纤方用于放射性肺纤维化的疗效及作用机制。方法:在体内实验中,36只6~8周龄雄性无特定病原(SPF)级C57BL/6小鼠被随机分为对照组、放射组(全肺17 Gy照射)、放射+化纤方组(全肺17 Gy照射+化纤方灌胃)。照射后16周,使用肺系数、HE染色和Masson染色评估肺泡炎症和肺纤维化程度,使用免疫组化染色检测肺组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平,使用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测肺组织中γ干扰素(IFN-γ)的mRNA表达水平;同时,使用ELISA法测定血清及肺泡灌洗液中IFN-γ的含量。在体外实验中,使用IFN-γ刺激6 Gy照射后的成纤维细胞NIH/3T3,继续培养48 h后,通过qPCR、免疫荧光染色、蛋白质印记法(western blot,WB)检测α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)转录及蛋白水平的表达。统计分析多组比较使用one-way ANOVA分析,组间多重比较采用Tukey检验。结果:与对照组相比,放射组的肺系数、肺泡炎评分、Ashcroft评分、肺组织α-SMA表达显著升高(P均<0.001)。相较于放射组,放射+化纤方组的上述指标均显著下降(P均<0.001)。qPCR检测结果显示放射+化纤方组IFN-γmRNA表达水平显著高于放射组(P=0.001);ELISA检测结果显示,与放射组相比,放射+化纤方组小鼠血清及肺泡灌洗液IFN-γ含量明显升高(P=0.032、0.037)。在体外实验中,放射后NIH/3T3细胞的α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA及蛋白表达显著升高,而在IFN-γ刺激后其表达明显降低。结论:化纤方能够有效缓解放射性肺纤维化,其机制与上调外周及组织IFN-γ,抑制成纤维细胞活化有关。

硫化氢对糖尿病大鼠肾脏病变的减缓作用

目的内源性硫化氢(H_2S)干预对糖尿病肾病大鼠肾小球病变的影响。方法把SD大鼠随机分成4组。建立糖尿病大鼠模型后,其中2组分别给以硫氢化钠和DL-propargylglycine治疗8周。免疫组化法检测肾组织中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及纤维粘连蛋白(FN)分布及含量的变化。结果与H_2s组相比,糖尿病大鼠肾脏中α-SMA和FN的分布范围广泛,含量明显增加(P<0.01)。结论外源性H_2S干预能够减缓糖尿病大鼠肾小球病变的进展。

肌动蛋白亚型在巨噬细胞吞噬脑膜炎大肠杆菌中的作用

该研究利用诱导后的THP-1单核细胞系作为巨噬细胞的模式细胞,鉴定了在巨噬细胞中表达的肌动蛋白亚型,发现β-肌动蛋白和γ-肌动蛋白在巨噬细胞中表达;接着利用共聚焦显微成像发现,β-肌动蛋白和γ-肌动蛋白在巨噬细胞受到脑膜炎大肠杆菌感染时均出现了不同程度的聚集;进一步利用RNA干扰技术实现了对巨噬细胞中的β-肌动蛋白和γ-肌动蛋白的特异性下调,并发现单独下调β-肌动蛋白和γ-肌动蛋白以及联合下调β-和γ-肌动蛋白都使得巨噬细胞吞噬脑膜炎大肠杆菌的能力呈明显下降。这些结果表明,不同亚型的肌动蛋白在巨噬细胞吞噬脑膜炎大肠杆菌过程中发挥着重要作用。

血管紧张素1—7对高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响及其机制

目的研究血管紧张素1-7（Ang1-7）对高糖诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化的影响及其可能机制。方法培养HK一2细胞分组如下：对照组（N组）、高糖组（H组）、高糖＋Ang 1-7组（A组）、高糖＋Ang1-7＋A779组（D组）、高糖＋吡格列酮组（P组）。Western印迹检测各组HK一2细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-1）及α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的蛋白表达；实时定量PCR检测HK-2细胞PPAR-1及仅-SMA的mRNA表达；免疫荧光检测d．SMA表达。结果Ang1．7可上调高糖刺激下HK-2细胞PPAR．1蛋白及mRNA表达（P〈0．05）；抑制高糖刺激的α-SMA蛋白及mRNA表达（P〈0．05）。这种作用与PPAR-1激动剂吡格列酮类似。给予Mas受体抑制剂A779后，Angl-7的上述作用可被部分抑制。结论Ang1-7在体外可通过上调PPAR．1表达，从而部分抑制高糖诱导的α-SMA表达，实现其抑制转分化的作用，而这种作用部分通过Mas受体所介导。

肝功能异常患者血清F-肌动蛋白表达及意义

目的探讨肝功能异常患者血清F-肌动蛋白表达水平变化及临床意义。方法肝功能异常患者71例(观察组),体检健康者83例(对照组),检测2组血清F-肌动蛋白、谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase,GPT)、谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,GOT)、γ-谷氨酰转移酶(7-glutamyl transferase,γ-GT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)水平;Spearman法分析观察组血清F-肌动蛋白与GPT、GOT、γ-GT、ALP水平的相关性;绘制ROC曲线分析血清F-肌动蛋白诊断肝功能异常的效能。结果观察组血清F-肌动蛋白[1.48(1.08,2.39)μg/L]、GPT[105.00(75.00,177.oo)u/L]、GOT[81.00(59.00,163.00)u/L]、γ-GT[127.50(50.25,314.75)u/L]、ALPEl31.50(97.25,152.32)u/L]水平均高于对照组[1.17(0.89,1.93)Fg/L、19.00(14.50,22.00)u/L、20.00(18.00,22.oo)u/L、17.00(13.00,24.50)u/L、84.00(74.50,98.75)u/L](P<0.05);血清F-肌动蛋白与GOT、ALP呈正相关(r=0.273,P=0.033;r=0.322,P=0.011),与GPT、γ一GT无相关性(r=0.217,P=0.094;r=0.112,P=0.392);血清F-肌动蛋白值以1.0429为最佳截断值,诊断肝功能异常的AUC为0.624(95%CI:0.535~0.713,P=0.009),灵敏度为80.3%,特异度为43.2%。结论肝功能异常患者血清F-肌动蛋白表达明显上调,检测血清F-肌动蛋白水平有助于肝功能异常的诊断。

Actin-γ在冠心病血小板中蛋白含量及白细胞mRNA转录水平的研究

目的检测Actin-γ在冠心病血小板中蛋白含量和外周血白细胞mRNA表达,探讨其在冠心病发病过程中的作用。方法纳入冠心病患者40例,健康对照组20例,运用流式细胞术检测单核细胞-血小板聚集体(MPAs)以观察血小板活化状态;应用蛋白免疫印迹(Western--blot)法检测血小板Actin-γ蛋白含量;采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测外周血白细胞Actin-γmRNA表达。结果与健康对照组相比,冠心病组MPA水平(P<0.01)和血小板骨架蛋白Actin-γ含量明显升高(P<0.01),且二者因冠心病不同类型有所差异;而白细胞Actin-γmRNA表达无统计学差异(P>0.05)。结论冠心病发病过程中血小板骨架蛋白Actin-γ重组为血小板活化和变形、聚集提供了机械来源,可能在冠心病疾病过程中发挥了一定的作用。