转小萝卜γ-硫堇蛋白基因RsAFP1水稻的获得及其稻瘟病抗性初步鉴定

将从小萝卜中分离的硫堇蛋白类基因RsAFP1通过基因工程的方法导入带有泛素Ubiquitin启动子及抗除草剂Bar基因的植物双元表达载体pCAMBIA1300中,经农杆菌介导对圣稻13进行遗传转化。对获得的阳性转基因植株进行稻瘟病菌体外及室内苗期稻瘟病菌接种抗性鉴定,结合田间自然发病情况,对转基因植株的抗稻瘟病性进行综合评价。初步结果表明,外源RsAFP1基因的导入可在一定程度上提高水稻对稻瘟病的抗性。

农杆菌介导法将小麦γ-硫堇蛋白基因转入厚皮甜瓜

以厚皮甜瓜鲁厚甜2号为材料,在绿色叶肉组织特异表达启动子PNZIP驱动下,利用农杆菌介导的遗传转化系统,将小麦抗真菌γ-硫堇蛋白(γ-Thionin)基因(THI)导入甜瓜,获得卡那霉素抗性植株。转化植株经PCR和Northern blot检测分析,证实γ-硫堇蛋白基因已经转入甜瓜基因组中并在甜瓜叶片组织中表达。

手掌参γ-硫素的原核表达及纯化

目的:在原核系统中高效表达手掌参γ-硫素,并对其进行纯化。方法:通过筛选手掌参cDNA文库获得γ-硫素基因(gcthionin),分别对其全长及信号肽编码序列缺失的cDNA片段进行PCR扩增,克隆入原核表达载体pET-32(a),构建重组质粒pET-32(a)/gcthionin和pET-32(a)/Δgcthionin;测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白;SDS-PAGE分析后,采用Ni-NTA亲和层析柱及凝胶柱对可溶性蛋白进行纯化,Western blotting鉴定。结果:gcthionin基因开放式阅读框全长225nt,编码一个由74个氨基酸残基组成的蛋白;带有信号肽的重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达;信号肽缺失可以极大地提高外源蛋白的可溶性,该可溶性产物经Ni-NTA柱及凝胶过滤后可获得纯度较高的蛋白,经Western blotting分析,相对分子质量约21.9×103处有明显的蛋白条带,与预期蛋白分子大小一致。结论:信号肽编码序列缺失的Δgcthionin可在大肠杆菌中可溶、高效表达。

苹果花粉中与花柱S-RNase互作的γ-硫堇筛选及鉴定

以‘国光’苹果（S1S2）花粉为材料,成功构建了酵母pGADT7-cDNA文库,转化效率约为1.2×106.μg-1,插入片段大小在300~2000bp之间。通过酵母双杂交方法,用苹果S2-RNase的C2HVC3区筛选文库获得一个长505bp的cDNA片段,经分析发现该cDNA序列上有一个261bp的开放阅读框（ORF）,该ORF编码一个具N端信号肽的多肽,该成熟多肽由64个氨基酸组成,富含带正电荷的赖氨酸和精氨酸,其C端有8个半胱氨酸和一个γ-硫堇功能域,结构预测显示其具有一个α螺旋,3个β折叠,4个二硫键,由此,推断其为苹果γ-硫堇,命名为MdD1。RT-PCR分析发现：MdD1基因在‘国光’苹果叶片、萼片、花瓣、子房、花药和花柱等组织中都有表达,但花药中表达量最高。酵母双杂交结果表明MdD1除了与苹果S2-RNase的C2HVC3区互作外,还与S1-RNase的C2HVC3区,S1、S2-RNase的成熟多肽区存在互作。初步认为：苹果γ-硫堇可能通过与S-RNase非特异性互作,作为花粉非S因子参与自交不亲和反应。