黄芪多糖上调γH2AX的表达提高宫颈癌细胞放疗敏感性的分析

目的研究黄芪多糖(APS)对宫颈癌Siha细胞增殖能力的影响,观察放疗后磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)的表达情况。方法体外培养Siha细胞,将其分为两组即放疗组和APS联合放疗组。应用CCK8法检测不同浓度APS对Siha细胞增殖活性的影响;Western blotting检测放疗4 h后两组γH2AX蛋白的表达水平。结果APS浓度越高,细胞的增殖活力越弱;APS作用时间越长,细胞增殖能力越弱(P<0.01);放疗后,APS联合放疗组γH2AX表达水平高于放疗组(P=0.031)。结论APS可以抑制Siha细胞增殖,促进γH2AX表达,从而提高放疗的敏感性。

2-乙酰氨基芴诱导γH2AX焦点的形成

目的探讨DNA损伤剂2-乙酰氨基芴(2-AAF)是否可诱导γH2AX焦点的形成及γH2AX作为检测DNA损伤的一个新的特异指标的可能性。方法用2-AAF处理中国仓鼠CHL细胞,应用免疫荧光方法检测γH2AX焦点的形成,并通过中性彗星实验验证DNA损伤的程度。结果0.1,1,5和20mg·L-1的2-AAF都可使细胞核内γH2AX焦点数量及有γH2AX焦点生成的细胞数量增加,但只有20mg·L-12-AAF处理的细胞才出现明显的彗尾增长及有彗尾的细胞数量增加。另外,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族抑制物渥曼青霉素可抑制2-AAF诱导的γH2AX焦点形成。结论2-AAF可通过激活PI3K家族成员使H2AX磷酸化,进而诱导γH2AX焦点的形成。γH2AX检测DNA损伤的敏感性优于彗星实验,因此,γH2AX有可能成为衡量DNA损伤程度的良好指标。

γH2AX磷酸化/去磷酸化的分子机制及检测技术进展

自从γH2AX在1998年首次发现以来,迅速成为多个学科领域的研究热点和研究工具。针对γH2AX建立的多种先进检测方法在生命科学和医学等多个领域内的应用展现了发展潜力。本文从其磷酸化和去磷酸化机制,各种检测分析技术的发展和建立,以及在相关领域里的应用进展等三个方面进行了综述。

应用γH2AX评估丝裂霉素致胃癌细胞DNA损伤

目的通过检测γH2AX,评估丝裂霉素对体外胃癌细胞DNA的损伤;同时,观察丝裂霉素对体外胃癌细胞增殖的影响。方法体外培养胃癌细胞株SGC-7901细胞,选用丝裂霉素处理,利用免疫荧光和Western-Blotting技术,分别检测γH2AX的焦点形成和蛋白水平变化;采用MTT法检测SGC-7901细胞的增殖情况。结果与对照组相比,实验组在每个时间点的γH2AX细胞百分数和平均焦点数都呈增加趋势,200μg/mL组和400μg/mL组的增加尤为明显,与对照组的差异有显著性(P<0.01)。用400μg/mL的丝裂霉素孵育SGC-7901细胞,γH2AX蛋白的水平变化呈先升后降趋势,差异有显著性(P<0.05)。MTT结果显示,丝裂霉素对SGC-7901细胞的增殖抑制明显(P<0.05)。结论γH2AX可敏感反应丝裂霉素对胃癌细胞DNA的损伤,潜在的临床应用价值极高;丝裂霉素对体外胃癌细胞增殖抑制明显。

γH2AX分析技术用于检测CT辐射剂量的初步研究

应用DNA双链断裂的生物标记物——γH2AX(H2AX组蛋白异型的磷酸化形式)的荧光显像即γH2AX分析技术,通过体外实验研究,了解CT辐射剂量与外周血单个核细胞(PBMCs)中产生的γH2AX荧光点数目的相关性,初步探讨其在检测CT辐射剂量方面的应用前景。观察结果表明,人外周血体外经CT扫描后DNA损伤诱发H2AX活化产生γH2AX,通过荧光显微镜检测到的γH2AX荧光点数目变化与CT扫描的照射剂量之间呈线性正相关,γH2AX分析具有直接作为检测CT辐射剂量的生物学标记的潜力。

γH2AX和ATM与内源性氧化剂所致DNA损伤关系的研究进展

本文综述了正常细胞及肿瘤细胞系中内源性氧化剂所致的磷酸化ATM(CAA)和γH2AX(CHP)的形成与表达;同时综述了各种影响因子和生长条件对CAA和CHP表达的影响。

γH2AX分析技术研究应用进展

细胞在电离辐射及其他因素作用下,会发生DNA损伤断裂,γH2AX分析技术可清楚地知道DNA损伤断裂程度及修复情况,因此,γH2AX已成为目前国内外研究细胞DNA损伤应激反应的热点之一.文章主要对γH2AX的研究应用进展作一综述.

DNA损伤标志物γH2AX在氧诱导视网膜新生血管形成中的作用

背景氧浓度变化诱导产生视网膜新生血管，并导致细胞DNA损伤反应。以往认为促血管生成因子过度表达是血管新生的原因，但DNA损伤是否与视网膜新生血管有关尚不清楚。目的探讨参与DNA损伤修复的磷酸化蛋白γH2AX与小鼠视网膜血管新生的关系。方法应用72只17日龄C57BL/6J小鼠按照随机数字表法随机分为正常对照组、氧诱导视网膜病变（OIR）模型组、OIR阳性对照组和OIR阴性对照组，每组18只。视网膜铺片免疫荧光法对比观察视网膜新生血管形态学变化及γH2AX表达情况。将人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）分为正常对照组、低氧模型对照组、阳性干扰组和阴性干扰组。细胞处理后12 h，采用免疫荧光法比较并分析各组γH2AX的表达情况，采用Western blot法定量检测各组γH2AX的表达。结果正常对照组、OIR模型组、OIR阳性对照组和OIR阴性对照组17日龄小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积比较，总体差异均有统计学意义（F＝437.62、93.05，均P〈0.01），其中OIR模型组和OIR阴性对照组小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积均较正常对照组明显增大；OIR阳性对照组小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积均较OIR模型组和OIR阴性对照组明显减小，差异均有统计学意义（均P〈0.01）。17日龄小鼠视网膜γH2AX焦点团聚集出现情况与新生血管和无灌注区面积大小变化趋势相一致。正常对照组、低氧模型对照组、阳性干扰组和阴性干扰组HUVECs中γH2AX焦点阳性细胞百分数比较，差异有统计学意义（F＝64.97，P〈0.01），其中低氧模型对照组和阴性干扰组γH2AX焦点阳性细胞百分数均较正常对照组明显增大，差异均有统计学意义（均P〈0.01）；阳性干扰组均较低氧模型对照组和阴性干扰组明显减小，差异均有统计学意义（均P〈0.01）。各组HUVECs间γH2AX的表达量与免疫荧光趋势相一致。结论缺氧环境下，γH2AX在小鼠视网膜血管和体外培养的HUVECs中均大量表达。γH2AX的表达与视网膜血管新生有关。低氧诱导的DNA损伤修复反应可能与视网膜血管新生有一定关系。

γH2AX:DNA双链断裂的标志

γH2AX是目前国内外研究细胞DNA损伤应激反应的热点之一。细胞在电离辐射或其他因素作用下直接诱导或是通过复制压力诱导形成的双链断裂(DSBs) ,以及细胞自身调控的程序性DSBs和逆转录病毒转染细胞过程中产生的DSBs均可诱导H2AX的磷酸化(γH2AX)和簇集。本文对H2AX及其组蛋白家族,以及γH2AX与DSBs之间的关系及可能作为一个探测DNA损伤的新分子探针来利用作一简要综述。

重离子所致DNA双链断裂损伤修复的γH2AX焦点响应

DNA双链断裂(DSB)是电离辐射所致基因组DNA的主要和最严重的损伤类型,磷酸化组蛋白γH2AX能比较特异地在DSB处形成焦点,是DSB的分子标志物之一。比较了重离子~7Li、^(12)C与γ射线辐照小鼠MEF细胞诱发γH2AX焦点的规律特征。结果显示,诱发形成的平均每个细胞的γH2AX焦点数目与照后时间相关,表达峰值出现在照后2 h,但不同类型辐射高表达的持续时间不同。在相同剂量下,致焦点形成率与辐射的LET值相关,LET值越高,形成率越大。γ射线诱发的γH2AX焦点尺寸随照后时间无明显变化,高LET重离子诱发的γH2AX焦点尺寸随时间变化先增加后减小;与低LET的γ射线相比,高LET辐射诱发的焦点平均尺寸明显变大,LET越高焦点尺寸越大且保持时间越长。

甲基硝基亚硝基胍诱导CHL细胞中γH2AX焦点的形成

背景与目的:研究甲基硝基亚硝基胍(MNNG)是否可诱导中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)中γH2AX焦点的形成,以及是否有细胞系依赖性。材料与方法:应用MTT试验检测不同浓度MNNG对鼠CHL细胞的生存率的影响;应用免疫荧光实验检测细胞中γH2AX焦点的形成。结果:MTT检测表明MNNG对CHL细胞的细胞毒性有明显的时间和剂量效应;免疫荧光实验发现1mg/LMNNG处理2h、8h、24h的CHL细胞中含有γH2AX焦点的细胞比例及焦点数均较对照组显著增加(P<0.05),含有超过30个γH2AX焦点的细胞比例分别达到56%,92%和91%。结论:MNNG可以诱导CHL细胞中γH2AX焦点的形成,并且有明显的时间效应。

无症状生殖道感染的男性不育患者γH2AX、白细胞亚群与精子DNA损伤关系研究

目的分析无症状生殖道感染的男性不育患者γH2AX、白细胞亚群与精子DNA损伤的关系。方法选取2016年8月至2018年8月银川市妇幼保健院泌尿外科门诊诊治的94例无症状生殖道感染男性不育患者作为研究对象。将这94例患者作为观察组,另选取同时期进行健康体检的94例有生育能力的健康男性作为对照组。采用免疫细胞法、流式细胞术检测精液中CD45^+白细胞、巨噬细胞系CD14^+抗原、活化巨噬细胞细胞HLA-DR^+细胞浓度及γH2AX含量,之后比较两组受试者精液中γH2AX、白细胞亚群水平与8-OHDG表达情况。结果观察组患者的精液γH2AX百分含量,CD45^+、CD14^+、HLA-DR^+白细胞亚群水平及8-OHDG精子百分率显著高于对照组受试者精液,差异具有统计学意义(P<0.05)。精液γH2AX百分含量与8-OHDG精子百分率的呈正相关,差异具有统计学意义(r=0.295,P<0.05);CD45^+、CD14^+、HLA-DR^+等白细胞亚群与8-OHDG精子百分率呈正相关,差异具有统计学意义(r=0.376,r=0.191,r=0.252,P<0.05)。结论无症状生殖道感染的男性不育患者精液γH2AX百分含量、CD45^+、CD14^+、HLA-DR^+白细胞亚群水平显著高于健康男性,且精子DNA损伤与γH2AX含量、不同白细胞亚群浓度呈正相关。

γH2AX对肺癌放射敏感性的预测效果

目的探讨人肺癌细胞受照后γH2AX表达量变化与肺癌细胞放射敏感性之间的关系。方法选择肺腺癌A549和小细胞肺癌SBC-3细胞株,采用细胞克隆形成实验检测经不同剂量(0、2、4、6、8、10 Gy)照射后A549和SBC-3细胞的克隆形成率,并绘制细胞生存曲线;应用Western blot检测经2 Gy放射剂量照射后不同时间点(0min、30 min、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h)的细胞中γH2AX蛋白表达量。分析γH2AX蛋白表达量变化与肿瘤细胞放射敏感性的相关性。结果小细胞肺癌SBC-3细胞的放射敏感性明显高于肺腺癌A549细胞。两种细胞受照后1 h和6 h,γH2AX的表达量均与肿瘤细胞的平均致死剂量(D0)相关。结论γH2AX可以作为肺癌细胞放射敏感性的一个预测指标。

4-溴联苯醚对大鼠睾丸γH2AX表达的影响

目的:分析4-溴联苯醚(4-BDE)对大鼠睾丸组织γH2AX表达的影响,进而探索4-BDE对雄性大鼠生殖功能影响及可能的机制。方法:SD雄性大鼠24只,随机分为4组:对照组,50、100、200mg/kg 4-BDE染毒组;对照组灌胃同等量的橄榄油,每天灌胃1次,连续30 d。大鼠处死后取睾丸进行HE染色,TUNEL法检测细胞凋亡,qPCR检测H2AX、Western印迹检测γH2AX表达情况。结果:与对照组相比,100、200mg/kg染毒组光镜下偶见生精小管内精原细胞、支持细胞减少或缺失。TUNEL结果显示与对照组相比,各染毒组大鼠睾丸组织凋亡指数明显增高,且随染毒剂量的增高凋亡指数呈上升趋势,差异有统计学意义(P<0.05);与50 mg/kg染毒组相比,100、200 mg/kg染毒组凋亡指数明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),存在剂量-效应关系,但100 mg/kg染毒组与200 mg/kg染毒组相比差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,各染毒组H2AX mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05);各染毒组之间比较差异也无统计学意义(P>0.05)。Western印迹结果显示,与对照组相比,染毒组γH2AX蛋白表达量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),各染毒组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:100、200 mg/kg 4-BDE染毒组大鼠睾丸组织内生精小管结构受损,染毒组睾丸组织内细胞凋亡均增加,γH2AX蛋白表达明显升高,DNA双链断裂(DSB)增多,细胞的凋亡可能与DSB有关。

γH2AX、53BP1及RAD51焦点用于分析DNA双链断裂损伤

γH2AX、53BP1及RAD51焦点(foci)是DNA双链断裂(DSBs)损伤修复的评价指标。其中,γH2AX分析应用最为广泛,但最新有研究发现其并不完全与DSBs损伤一致。系统分析了DNA损伤时γH2AX、53BP1及RAD51 foci的动力性变化及其在DSBs损伤评估中的合理应用。结果表明,在电离辐射处理时,γH2AX和53BP1 foci具有高度一致性,均可反映DSBs损伤及修复的动力性变化,而RAD51 foci仅出现在部分损伤细胞中,与其主要参与同源重组修复一致。在喜树碱(CPT)处理时,γH2AX呈现两种染色类型(亮而离散的foci和泛核磷酸化),53BP1 foci仅出现在亮而离散的γH2AX foci阳性细胞且与其高度一致。结果提示,单独γH2AX染色阳性并不能准确代表DSBs损伤,而应结合53BP1等染色来综合分析DSBs损伤程度;RAD51 foci分析仅能反映部分细胞的DSBs损伤修复(主要是同源重组)情况。

低剂量辐射诱导小鼠骨髓单个核细胞γH2AX形成的时间剂量效应

目的探讨正常造血组织在全身低剂量照射后的放射生物学效应。方法将96只雌性昆明小鼠随机分为8组,暴露于0～800mGyγ射线下。分别于照射后24、48、72h处死,制备单个核细胞悬液。加γH2AX抗体染色后应用流式细胞仪检测其荧光强度。结果单染及双染法结果均显示γH2AX表达呈J型曲线,所有时间剂量组中,100mGyγ射线在48h时诱发的DSB数量最少。结论γH2AX的表达水平可以反映DNA双链断裂及修复情况。造血组织低剂量照射后可以产生兴奋效应。

幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白不同片段对胃癌细胞γH2AX表达的影响

目的探讨幽门螺杆菌(H.pylori)细胞毒素相关基因A(CagA)蛋白不同片段对胃癌细胞磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)表达的影响。方法取前期分离的H.pylori东亚株GZ7及其CagA敲除株H.pylori GZ7ΔCagA感染的癌细胞株AGS,采用免疫荧光方法检测DNA双链断裂标志物γH2AX的表达;构建不同序列的CagA表达载体(载体a、b、c、d、e),转化大肠杆菌,提取质粒后测序鉴定,将鉴定后的载体转染AGS,采用免疫荧光方法检测γH2AX的表达,并通过流式细胞术检测细胞周期。结果成功鉴定了含不同片段的CagA载体;H.pylori GZ7感染的胃癌细胞AGS核内γH2AX的表达高于H.pylori GZ7ΔCagA感染的细胞(P<0.05);与NC组比较,不同序列CagA载体转染后胃癌细胞AGS中γH2AX表达均有增加(P<0.05或P<0.01),且载体b、c及d表达增加较明显(P<0.01);载体a和c转染后的胃癌细胞AGS的G0/G1期细胞比例升高(P<0.05),载体b、c、d及e转染后胃癌细胞AGS的G2/M期比例明显升高(P<0.01)。结论CagA是H.pylori感染诱导胃癌细胞DNA双链断裂的重要因素,CagA中的EPYIA基序是这种DNA损伤的重要结构。

与细胞周期G_2/M期进程相关的H2AX磷酸化

γH2AX焦点(foci)被普遍当做DNA双链断裂(DSB)损伤的分子标志物.为探讨细胞周期进程相关的H2AX磷酸化规律特征,采用胸腺嘧啶双阻滞结合噻氨酯哒唑(nocodazole)的后续处理,将HeLa细胞同步于有丝分裂的前中期.然后,用流式细胞仪检测细胞周期、Western印迹和免疫荧光法,观察γH2AX表达和γH2AX焦点的形成.结果显示,细胞进入G2/M期和有丝分裂过程中,γH2AX水平显著增加;在无DNA DSB发生的情况下,部分M期细胞中也存在大量的γH2AX焦点.随着细胞完成有丝分裂从M期退出再进入G1期,γH2AX的表达水平逐渐降低.这种γH2AX表达变化特征与G2/M期密切关联的PLK1和Cyclin B1的表达规律相类似.在4 Gy大剂量照射下,HeLa细胞于照后8到12 h出现明显的G2/M期阻滞.γH2AX焦点数在照后1 h达高峰,随后降低,照后8 h又上升,出现了第2个峰值.与之不同的是,在1 Gy低剂量照射下,细胞的G2/M期阻滞微弱,γH2AX焦点数在照后0.5 h最高,随后下降,且无反弹,符合DNA DSB的修复动力学特征.因此,将γH2AX当做DNA DSB分子标志物时,还需要考虑细胞周期变化的影响.γH2AX适合作为1 Gy以下照射的DNA双链断裂损伤的分子标志.

^60Coγ射线诱导EJ细胞DNA损伤及γH2AX表达的研究

目的探讨不同剂量^60Coγ射线对EJ细胞DNA损伤的情况，不同剂量^60Coγ射线照射EJ细胞后诱导磷酸化组蛋白H2AX焦点形成，以及与γH2AX表达量的关系。方法单细胞凝胶电泳检测DNA链断裂损伤情况。免疫荧光法检测不同剂量γ射线照射后立即、以及2Gyγ射线照射后不同时间的EJ细胞中γH2AX焦点的数量。流式细胞分析法检测不同剂量γ射线照射后EJ细胞中γH2AX蛋白表达量的变化。结果单细胞凝胶电泳结果显示，γ射线照射后DNA损伤情况明显加重，随照射剂量的增加，细胞尾矩不断加大，0 Gy组尾矩为0．24，4Gy照射组尾矩为5．26；免疫荧光结果显示，随着照射剂量的增加，γH2AX焦点数目及大小均明显增加，照射的剂量范围从0．1～4Gy均可检测，且照射剂量和焦点形成数目之间存在剂量-效应关系，0．1Gy照射组每个细胞中的焦点数平均达12．37个，4Gy照射组每个细胞中的焦点数平均达46个；2Gy7射线照射后24h仍可检测到γH2AX焦点，随时间延长焦点数目减少、强度减弱，具有时间依赖性。流式细胞检测结果表明，γ射线照射后γH2AX蛋白表达量明显增加，呈现明显量效关系，0．1和4Gy照射组γH2AX阳性细胞表达率分别为7．4％和29．2％。结论免疫荧光法检测照射后γH2AX焦点数目比其他实验方法更能敏感、直观的反映DNA损伤及修复情况，有望成为检测辐射损伤的理想生物指标。