普通小麦品种豫麦34和郑丰5号ω-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

ω-醇溶蛋白是影响小麦加工品质和诱发乳糜泻（celiac disease,CD）的面筋蛋白之一。为给小麦加工品质的分子改良和预防乳糜泻提供参考依据,利用3对特异引物,采用基因组PCR法,从优质小麦品种豫麦34和郑丰5号中克隆获得41个ω-醇溶蛋白序列。NCBI BLAST分析表明,克隆序列与已知序列的相似度均在91%-99%之间,推断其为ω-醇溶蛋白基因家族的基因。开放阅读框识别分析表明,11个序列（Y34W-1-Y34W-7,ZFW-1-ZFW-4）具有完整的开放阅读框,可编码203-377个氨基酸残基。ZFW-4和Y34W-1在重复区的插入片段中存在1个额外的半胱氨酸残基。CD免疫肽识别分析表明,11个基因中均分布有3种ω-醇溶蛋白的T细胞免疫肽,且肽段PQQPFPQQ存在多个拷贝。聚类分析显示,ω-醇溶蛋白具有一定的基因组特异性,11个克隆的基因与尾状山羊草（Aegilops markgrafii）和粗山羊草（Aegilops tauchii）的ω-醇溶蛋白基因序列具有相对较高的同源性。

一个小麦ω-醇溶蛋白基因同源序列的分离与序列分析

通过基因组PCR克隆了小麦济南177的一个ω-醇溶蛋白基因同源序列(ω1236),该序列包括部分5′、3′侧翼序列和全部可能的编码序列,没有内含子,但在第87、117、125、160、198、313、357和365氨基酸残基处有终止密码子,所有8个终止密码的形成都是碱基转换的结果。比较分析发现,该序列与一个ω-醇溶蛋白基因序列(AB059812)有98%的同源性。推导的氨基酸序列表明该基因符合禾谷类醇溶蛋白的特点。系统进化分析表明,该序列与小麦ω醇溶蛋白在进化上亲缘关系较近,与α-,β-,γ-醇溶蛋白基因关系较远。ω1236推导的氨基酸序列编码了一个可能的47.2 kDa的蛋白质。转化大肠杆菌发现,在IPTG诱导后最初2 h,有小肽段产生,这说明在该基因序列中可能存在终止密码,这与测序结果是一致的。该研究为用PCR技术克隆ω醇溶蛋白基因和进一步研究ω醇溶蛋白基因的结构和功能积累了资料。

郑麦369 ω-醇溶蛋白基因的克隆及生物信息学分析

以黄淮麦区主推小麦品种郑麦369为材料,利用简并引物和PCR扩增技术对其ω-醇溶蛋白基因进行克隆,获得15条ω-醇溶蛋白核苷酸序列(分别命名为ZM369-1~ZM369-15)。NCBI BLAST分析表明,克隆序列与已知序列的相似度均为82%~99%,推断其为ω-醇溶蛋白基因家族基因。通过FGENESH在线软件预测显示,ZM 369-1和ZM369-15具有完整的开放阅读框,分别可编码318,407个氨基酸残基;其余13条序列均因内部提前出现1个或多个终止密码子,推测其为假基因。进一步分析显示,15个基因推导的氨基酸序列均具有ω-醇溶蛋白典型分子结构特征,其中ZM 369-15属于未曾报道过的ARP类型,同时在重复区存在1个半胱氨酸残基的插入。此外,在NCBI数据库中没有找到与ZM 369-1和ZM369-15相似度高的ω-醇溶蛋白氨基酸序列,推测其为新ω-醇溶蛋白基因。CD免疫肽识别分析表明,免疫肽段Gli-ωt在15条氨基酸序列中均有分布,免疫肽段Gli-ω1只分布于假基因推导得到的氨基酸序列中。系统进化树分析表明,本研究克隆得到的15个基因分别来源于A,D基因组;相同基因组来源的ω-醇溶蛋白基因大都可形成相对集中的分支,表明其具有一定的基因组特异性;相同类型ω-醇溶蛋白基因都能形成相对集中的分支,推测其类型与进化有关。

小麦属物种ω-醇溶蛋白序列的克隆与分析

为了挖掘ω-醇溶蛋白在小麦品质育种中的潜力,利用2对引物采用基因组PCR方法分别从阿拉拉特小麦（Triticum timopheevi Zhuk.var.araraticum）、栽培二粒小麦（Triticum turgidum ssp.dicoccon）、提莫菲维小麦（Triticum timopheevi）、栽培一粒小麦（Triticum monococcumssp.monococcum）和野生一粒小麦（Triticum monococcum var.boeoticum）5个小麦属物种中克隆出ω-醇溶蛋白序列,并对其进行序列分析。结果表明,本研究共克隆到6条新的ω-醇溶蛋白序列,归属于ARH、ATN和TRQ三种类型。这些新的ω-醇溶蛋白序列的长度为927~1 095bp。在这6个序列中,除KR082150拥有两个甲硫氨酸（Met）外,其余的均缺少含硫氨基酸。进化分析表明,本研究获得的6条ω-醇溶蛋白序列聚在了2个主要的分支,其中N端第一个氨基酸为丙氨酸（Ala）的ω-醇溶蛋白聚在了一个大的分支中,而TRQ类型的则聚在了另一个分支中。

偏凸山羊草fast ω-醇溶蛋白基因克隆及与WDEIA相关的IgE结合抗原表位分析

克隆偏凸山羊草中的fastω-醇溶蛋白基因,并对其序列和IgE结合抗原表位进行分析,以期了解IgE结合抗原表位在D^v和M^v基因组中的分布,并为制备单克隆抗体进行IgE结合抗原表位的定量分析奠定基础。结果表明,从偏凸山羊草中克隆获得8个fastω-醇溶蛋白基因(KY368672—KY368679),其中,3个fastω-醇溶蛋白(KY368672—KY368674)由D^v基因组编码,其余5个(KY368675—KY368679)由M^v基因组编码。序列分析发现,获得的fastω-醇溶蛋白与已发表的fastω-醇溶蛋白具有相似的序列结构,KY368672为SRQ型ω-醇溶蛋白,KY368673和KY368674为TRQ型ω-醇溶蛋白,KY368675—KY368679均为SRL型ω-醇溶蛋白。另外,在M^v基因组编码的fastω-醇溶蛋白中,发现了与α-醇溶蛋白相似的多聚谷氨酰胺序列。IgE结合抗原表位分析表明,M^v基因组编码的fastω-醇溶蛋白比D^v基因组编码的fastω-醇溶蛋含有更多的IgE结合抗原表位。

小麦相关蛋白特异性IgE检测在小麦依赖-运动诱发的严重过敏反应中的诊断价值

目的评估不同小麦相关蛋白过敏原在小麦依赖-运动诱发的过敏反应(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis,WDEIA)诊断中的临床价值,完善WDEIA的实验室诊断方法。方法收集31例疑似WDEIA患者,总结临床信息,检测小麦相关蛋白特异性IgE抗体,统计分析不同小麦相关蛋白特异性IgE抗体在WDEIA诊断中的灵敏度和特异度。结果31例患者均曾在运动时发生严重过敏反应,有13例随访期间过敏,可诊断为WDEIA。小麦相关蛋白特异性IgE检测显示,20例患者有阳性反应,其中阳性率最高的为3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),其次为ω-5醇溶蛋白和小麦花粉提取物。上述3种蛋白诊断性分析的灵敏度分别为53.8%、53.8%、23.1%;特异度分别为66.7%、88.3%、88.9%。ω-5醇溶蛋白联合小麦花粉提取物的灵敏度(76.9%)和特异度(72.2%)均较高。结论WDEIA是一种罕见的严重过敏性疾病,以颜面水肿、全身性皮疹、呼吸困难、腹痛腹泻、冷汗和晕厥为主要表现。临床病史及随访对WDEIA的诊断至关重要,而小麦相关蛋白特异性IgE检测可为诊断WDEIA提供参考,其中ω-5醇溶蛋白和小麦花粉提取物联合检测具有最高的诊断价值。