蓝舌病新疆分离株VP7蛋白编码基因序列分析及一步法RT-PCR方法的建立

【目的】分析蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,建立蓝舌病新疆分离株一步法RT-PCR方法,为新疆BTV分子流行病学调查及防控提供技术支持。【方法】采用二代测序技术获得新疆分离株S7基因序列,登陆GenBank对序列进行同源性Blast比对,用软件MEGA 5.0分析序列差异,根据蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,运用软件Oligo6.0设计引物,对蓝舌病新疆分离株S7基因进行RT-PCR扩增,并验证该方法的特异性及敏感性。【结果】蓝舌病中国新疆分离株编码VP7蛋白S7基因序列与哈尔滨报道BTV分离株S7基因片段相似度较高为89.64%,与中国云南报道BTV-29型分离株、蒙古国BTV分离株S7基因片段相似度分别为87.49%和87.39%;与德国BTV分离株S7基因片段相似度为80.70%,其余均无同源性序列。中国新疆分离株S7基因片段序列与4条同源序列间存在26处核苷酸差异,9处氨基酸差异。【结论】建立的蓝舌病中国新疆分离株S7基因片段一步法RT-PCR方法具有良好的特异性,仅BTV中国新疆分离株扩增获得目的条带,该方法的敏感性为4.0×10^(3)copies/mL。

一种灰色关联分析优化ICEEMDAN的VP倾斜仪信号降噪模型

VP倾斜仪固体潮信号受仪器监测复杂环境限制,多含有大量环境噪声。为获得真实固体潮曲线,提出一种基于灰色关联分析优化改进的自适应噪声完备集合经验模态分解(ICEEMDAN)VP倾斜仪信号降噪模型(GRA-ICEEMDAN)。该方法首先将含噪信号进行ICCEMDAN处理,得到若干个固有模态函数(IMF),并依次排列与标记;然后基于这些IMF分别计算相关系数、互信息、R^(2)、Adj-R^(2)、MSE、SSE、RMSE、MAE、MAPE、样本熵等10个评价指标值,构建IMF可信度评价指标矩阵;最后借助灰色关联分析(GRA)计算各评价指标与不同IMF之间的关联系数和关联度,依据关联度大小对各个IMF进行排序,将排名靠前的IMF进行线性重构,即可完成信号降噪。仿真去噪实验和实测去噪实验均表明,GRA-ICEEMDAN模型优于卡尔曼滤波、70阶低通FIR滤波、Savitzky-Golay等经典降噪模型,能显著区分噪声成分和有效成分,原始信号分解后的重构误差与信号损失极小,可推广至其他仪器的复杂信号降噪中。

OPA柱前衍生化HPLC同时测定川红工夫红茶20种氨基酸含量

建立在线柱前衍生液相色谱法同时测定不同品种川红工夫红茶中的20种氨基酸含量,并评价其与滋味品质相关性。以邻苯二甲醛(OPA)为衍生试剂,利用液相色谱仪的自动进样器进行柱前衍生,采用Hypersil BDS C 18柱(150 mm×4.6 mm,3μm),以0.016 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH=8.2)与甲醇-乙腈-水(4.5∶4.5∶1,V∶V∶V)组成流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温50℃,荧光检测器激发波长340 nm、发射波长450 nm;通过相关分析,比较不同滋味属性氨基酸含量与红茶滋味的相关性。结果表明:20种氨基酸在0.195~2.584μg/mL的范围内与各自峰面积呈良好的线性关系,其相关系数为0.9954~0.9999,检测限为0.006~0.036μg/mL,定量限为0.020~0.184μg/mL,加标回收率为90.40%~99.13%;除四川群体种红茶和梅占红茶中未检出组氨酸外,其余氨基酸均在5个品种红茶中检出,氨基酸总量27.33~65.29 mg/g之间,其中含量最高的是黄金芽红茶,氨基酸组分中,含量最高的是茶氨酸,然后是天冬氨酸和谷氨酸;红茶中的鲜味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸、氨基酸总量与红茶的鲜味、甜味和综合滋味评分呈显著或极显著正相关,对红茶滋味的鲜爽度和浓强度起着重要作用。采用OPA柱前衍生反相液相色谱荧光法检测氨基酸组分精密度和回收率高,具有成本低、快速、准确的特点,可用于红茶中20种氨基酸组分的快速测定。

抗鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其应用研究

为制备针对鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的单克隆抗体,以CIAV的VP2原核表达蛋白作为抗原免疫小鼠,经杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗VP2蛋白特异性抗体的细胞株,进一步经IFA筛选出特异性和灵敏度俱佳的杂交瘤细胞Mab-VP2-4株,制备的小鼠腹水效价达到1∶2000。结果显示,制备的抗VP2蛋白单克隆抗体可与多株CIAV感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应,而对EDSV、ALV、ILTV、ARV以及空白MDCC-MSB1细胞、CEF细胞等均无交叉反应,特异性良好,且应用于IFA方法时对CIAV感染的最低检出限为5 TCID 50。以该单克隆抗体对市场上10种不同来源的禽活疫苗进行病毒分离结合单克隆抗体IFA检测,同时与《中国兽药典》规定的鸡检查法进行对比检测,结果一致,均未检出CIAV污染。本研究制备了针对CIAV VP2蛋白的特异性单克隆抗体,为该病特异性诊断方法的建立奠定了基础。

“絜矩之道”与“感而遂通”——儒家恕人工夫论前提的哲学分析

儒家一向主张以“絜矩”去体谅别人、通达他者。《大学》将其上升为一种普遍的德性工夫,把内在自觉推扩到同类的身上。人心之间的沟通必须以天人之间的沟通为前提,天人相通的理性预设可以使人心之间的相感获得绝对的普遍性。天人合体而不隔,天之则即是人之则。由《周易·感卦》兑上艮下的结构则可知阴阳二气感应以相授与。感应离不开性情,并以性情为先验基础。类是感应的对象性前提。万物身上都潜藏着可以与别物相交流、相沟通的可能性,物始终开显着自身,等待别物的进入和通达。《易传》强调圣人在沟通天人过程中所发挥的重要作用,圣人用性情之心去“会通”天文地理与天下之动,实现与天、与神相统一。

临武土话的“有咯/冇咯+VP”结构

临武土话中有“有咯/冇咯+VP”结构,其中“咯”为语气助词。与其他南方方言中的“有+VP”结构相比,“有咯/冇咯+VP”结构中“咯”的介入,话语层次和句法层次有了形式上的界线,结构各构成成分承担的语义也能明确区分。“有/冇”表示存在的肯定与否定,“咯”表示主观确认,VP表示事态,“有咯/冇咯+VP”的结构义为“确认事态存在的肯定/否定”。“有咯/冇咯”具有话语标记功能的插入成分。

九江市2017—2023年手足口病流行病学特征及CVA6 VP1基因特征分析

目的了解九江市手足口病的流行特征及病原学分布,对优势病原的VP1基因进行分析。方法收集2017—2023年九江市手足口病疫情和病原学监测资料,用荧光定量RT-PCR方法对临床诊断病例样本进行肠道病毒(EV)核酸检测,2022—2023年对检出的CVA6样本进行病毒分离、VP1区全长测序分析。结果2017—2023年九江市共报告病例29133例,年均发病率90.63/10万(56.62/10万~116.13/10万);各县区年均发病率为30.93/10万~271.65/10万。1~3岁是高发年龄段,5—7月为发病主高峰(占45.07%)。2017—2021年其他肠道病毒为优势病原(74.09%)。2022年开始检测CVA6、CVA10,2022年、2023年CVA6分别占38.85%(122/314)、53.73%(173/322),已成为优势病原,CVA6九江分离株与原型株之间的核苷酸序列同源性为88.99%~92.89%,氨基酸同源性为89.24%~94.52%,绝大部分属于D3基因亚型的D3a进化分支。结论九江市手足口发病率较高,CVA6已成为优势病原,D3a进化分支为优势流行型别。

中晚明诸名家文学创作工夫论概述

中晚明文学工夫论或承于传统的文学艺术工夫论,或根于朱熹格物致知之工夫论,或鉴于王学致良知的工夫论,或源于禅宗明心见性的工夫论,或合孟子的“知言”“养气”工夫为一体。如李东阳、王世贞、胡应麟、许学夷等人的文体工夫论重视学养、强调对文体规范、篇章字句之法的掌握;唐顺之、李贽、袁宏道等人的文学创作主体工夫论指向心性的修炼、知识的效用,主体精神的大解脱;王阳明倡导在心性本体上下工夫,至刘宗周、黄宗羲等则主张以工夫作为“存养”身心锻炼的本体。这亦势必影响其文学创作观念。充分认识中晚明诸名家文学创作工夫论的价值,对重新建构与阐释明代文学批评体系具有重要的理论意义。

“VP+X+算/是+X”构式的语义兼容及其认知机制

“VP+X+算/是+X”构式语义具有兼容性。构式兼容基于充分条件的“动尽其量”和必要条件的“动尽其量”两种语义,前者强调动量的效力以及效力的范围,后者主要强调能力范围限度内的效力,二者在形式互证方面各不相同。语义兼容的产生与认知扫描差异有关,基于充分条件的“动尽其量”是总括扫描的反映,基于必要条件的“动尽其量”是次第扫描的结果。

鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定及VP2蛋白的原核表达

为了获得鸭源新型鹅细小病毒(NGPV)流行毒株并表达VP2蛋白,试验采集患短喙侏儒综合征的死亡鸭肝脏组织病料样本,首先通过鸭胚传代培养分离病毒,然后对分离毒株进行血凝试验、PCR检测、鸭胚半数致死量(ELD_(50))测定及致病性试验,最后对VP2蛋白进行诱导表达、可溶性分析、纯化及Western-blot鉴定。结果表明:从临床病料样本中分离到1株病毒,将该毒株接种鸭胚,鸭胚的死亡时间均集中在接种后的第48~72小时之间,死亡鸭胚出现绒毛尿囊膜增厚、胚体有大量出血点、鸭喙短小等短喙侏儒综合征的典型病变特征,将分离毒株命名为SCNC01株。SCNC01株不能凝集1%鸡红细胞,在其基因组DNA中可扩增出NGPV NS1基因序列,该序列与GenBank中的NGPV NS1基因序列相似性在90.6%~98.3%之间,SCNC01株与MK000549、MN415966、JF333590、KC996729、KT598506、MW929338等NGPV毒株处于同一分支,确定该毒株为NGPV。SCNC01株的ELD_(50)为1×10^(-4.5)/0.2 mL,可引起雏鸭出现运动障碍、食欲下降、精神萎靡、喙萎缩、舌头外翻、排白色稀便等临床症状甚至死亡。经IPTG诱导NGPV VP2蛋白获得了表达,且表达形式为包涵体,经His-Tag蛋白纯化柱纯化后,出现与目的蛋白大小一致的单一条带,该蛋白能与NGPV阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。说明试验成功分离到1株鸭源NGPV,并获得了具有良好反应原性的VP2蛋白。

先立其大,易简工夫,道不外索——论陆九渊的学习价值观

陆九渊的学习概念是广义的,涵盖求学、治学及借以成人等。通过对天人、义利和理欲关系的辨析,确立“人与宇宙相统一”“志乎义”和“从大体”的价值取向,进而对“学”的发端、动机和功能等进行规定。基于“先立其大”“易简工夫”和“道不外索”三项“学”的价值规范,提出学习应先立其大而不应立卑小志向和目标,应易简工夫而不应支离事业,应道不外索而不应向外求知真理,进一步明确应怎样学而不应怎样学的问题。以“成人”和“行道”的价值理想体现“学”的最高价值追求。陆九渊的学习价值观给我们的启示是学习的目的、内容和方法有主次本末之分,应以德为先;学习须先立志,应志存高远;学习应整体明悟,不能拘泥于细枝末节;学习应独立思考,不能迷信书本教条;学习应躬行实践,不能埋没于文义。

A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和VP2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。

鸡群中鸡传染性贫血病原与抗体检测及分离株VP1基因序列分析

为了解鸡群中鸡传染性贫血病毒(CAV)感染及抗体产生情况,从黑龙江省两个无临床症状鸡群(B群和S群)中,分别采集血清通过ELISA方法进行抗体检测,采集抗凝血并分离淋巴细胞,针对基因组保守序列设计引物,通过PCR方法进行病原检测,并对从B群病原阳性鸡分离到的分离株进行VP1基因序列分析。结果显示,B群和S群CAV抗体阳性率分别为62.7%(79/126)和68.2%(88/129),病原阳性率分别为43.0%(49/114)和62.3%(48/77),其中,B群和S群中抗体和病原双阴性的鸡分别为23.7%(27/114)和15.6%(12/77),而抗体和病原双阳性的鸡分别高达28.1%(32/114)和46.8%(36/77);在双阳性鸡中,B群和S群分别有62.5%(20/32)和58.3%(21/36)抗体滴度在1.0×10^(4)及以上,从B群病原阳性鸡全血中分离到一株CAV(HLJ/2022株),分离株HLJ/2022第394位氨基酸为谷氨酰胺,具有强毒的分子特征;两个鸡群的环境拭子CAV阳性率为10.0%(3/30),存在于消毒前的鸡蛋表面、更衣处和鞋底。研究表明,检测鸡群的CAV抗体阳性率在62.7%以上,病原阳性率在43.0%以上,抗体滴度在1.0×104及以上CAV仍可存在,CAV流行株(HLJ/2022)具有强毒分子特征,鸡群环境中存在CAV污染,结果为CIA防控提供重要的参考意见。

辽宁沈阳株猫泛白细胞减少症病毒VP2基因扩增及生物信息学分析

【目的】通过生物信息学方法分析1株2022年辽宁沈阳地区猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus, FPV)LN3株VP2蛋白的分子特征。【方法】利用FPV胶体金试纸条对临床上表现呕吐、腹泻等症状的患病猫粪便进行检测,提取该病猫粪便的病毒DNA进行FPV VP2基因PCR扩增及测序,使用Seqman软件对序列进行拼接。将所获序列与NCBI数据库中FPV和犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)的VP2基因进行相似性比对及遗传进化分析。使用生物信息学软件对该毒株VP2蛋白进行预测,包括理化性质、亲/疏水性、跨膜区、糖基化位点、亚细胞定位、二级结构、三级结构等。【结果】FPV LN3株VP2基因全长1 755 bp,编码584个氨基酸;与GenBank上登录的15株FPV同属一个大分支,相似性为98.9%~99.7%;与CPV处于不同分支上。生物信息学软件预测显示,FPV LN3株VP2蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构;含有7个潜在N-糖基化位点、86个O-糖基化位点和50个磷酸化位点;VP2蛋白在细胞质、细胞核、线粒体中的可能性分别为43.5%、34.8%和21.7%;VP2蛋白二级结构中无规则卷曲、α-螺旋、延伸链、β-转角分别占61.82%、8.90%、24.32%及4.97%,三级结构预测结果与其一致;VP2蛋白共有20个抗原表位。【结论】VP2是FPV遗传变异的关键基因,FPV LN3株VP2蛋白属于亲水性、非跨膜稳定蛋白,共存在20个抗原表位。试验结果为进一步研究FPV VP2蛋白功能及研发新型疫苗提供理论依据。

天津蓟县地震台两套VP宽频带倾斜仪数据对比分析

蓟县地震台是天津地区唯一的基岩出露台,台站两套VP宽频带倾斜仪分别安装在新山洞和小辛庄山洞。通过对蓟县台的两套VP宽频带倾斜仪数据内在质量、同震响应、环境影响、仪器维修等方面的对比分析,得出以下结论:以2023年为例,两套仪器的潮汐因子稳定性均较好,由于摆系故障,新山洞VP宽频带倾斜仪NS向精度比较差。通过2018—2023年对比,小辛庄山洞VP宽频带倾斜仪具有明显的年变形态,新山洞VP宽频带倾斜仪年变形态不明显,这可能与新山洞地质区域性节理发育以及台站周围抽水影响有关。强降雨、气压等自然环境变化会对两套仪器观测造成一定影响。两套VP宽频带倾斜仪均有较强记录地震的能力,能够清晰的记录到远场地震几秒至几十秒周期面波,对于近场中强震可以清晰记录P波初至,但是后续震相识别较为困难。针对新山洞VP宽频带倾斜仪EW向曾经出现的不定时突跳错数的故障,总结归纳了维修过程,为同类仪器运维提供参考。

贵州省2017年~2023年PEDV和PoRVA流行病学调查及PoRVA VP7、VP4基因的遗传演化分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪A群轮状病毒(PoRVA)的流行情况,本研究对2017年~2023年来自贵州省9个地区139个猪场的165份仔猪粪便样品进行Taq Man RT-qPCR检测,并对PoRVA阳性样品VP7、VP4基因进行RT-PCR扩增、测序,遗传进化分析及其编码氨基酸序列的变异分析。结果显示,PEDV、PoRVA和PEDV+PoRVA的感染率分别为67.88%(112/165)、38.79%(64/165)和21.21%(35/165),且在不同年份、不同地区和不同季节均检出三者的感染。PCR结果显示,本实验扩增出27株PoRVA VP7基因和22株VP4基因;遗传进化分析结果显示共鉴定出6种G型和3种P型,其中G9(29.63%)和P[13](68.18%)为优势基因型,G3、G4、G5、G11、G26、P[6]和P[23]分别占7.41%、22.22%、22.22%、3.70%、14.81%、13.64%、18.18%。21份PoRVA样品鉴定出10种G/P组合基因型,G9P[13](19.05%)为优势组合基因型,G4P[13]、G5P[13]、G3P[13]、G4P[6]、G5P[23]、G9P[23]、G11P[13]、G26P[6]、G26P[13]分别占14.29%、14.29%、9.52%、9.52%、9.52%、9.52%、4.76%、4.76%及4.76%。同源性分析结果显示,27株VP7基因和22株VP4基因序列与NX疫苗株相应基因序列之间的同源性分别为75.5%~94.0%和68.5%~75.6%,氨基酸序列的同源性分别为78.3%~96.6%和72.0%~82.5%,部分PoRVA上述基因序列与国外、人源RVA的同源性最高。氨基酸位点变异分析结果显示,与NX疫苗株相比,所测PoRVA VP7和VP4氨基酸序列均存在特征性位点的变异,其中G型PoRVA VP7无氨基酸位点的缺失和插入,G9型PoRVA VP7存在3处(I^(208)T、K^(212)A/V/T、V^(271)I)变异,G3、G4、G5、G11和G26型PoRVA VP7存在17处(S^(28)R/K、A^(29)I/T/M/V、L^(40)I/V、V^(44)L、S^(71)T、Q^(73)G/N/S/E、S^(90)A/Q/K/R、G^(94)N/S/A/K、N^(100)D/E、T^(122)A/S、T^(147)A/G/N/D、Q^(189)S/T、I^(208)L/Q/T、K^(212)T/I/P/N、A^(213)N/T/D、E^(267)D/N、V^(271)I)变异;3株P[6]型PoRVA VP4在aa136缺失T,13株P[13]型PoRVA VP4在aa188~aa189插入E/D~Y/F,P[6]、P[13]和P[23]型PoRVA VP4存在26处(I^(92)V、Q^(94)E、Q^(113)T/P/N、T^(114)N/Q/S/R、T^(115)Q/E、N^(116)S/L/T、P^(148)A/Q/V/S/I、T^(180)E/N/D、P^(162)T、I^(174)V/L、C^(269)Y、R^(281)N、A^(286)L/S、T^(302)N、A^(340)S/V、T^(379)S、T^(403)A、S^(438)P、R^(553)K、A^(569)A、M^(570)L、A^(608)S、E^(660)D、I^(726)F、K^(733)N、S^(739)T)变异。上述结果表明,2017年~2023年贵州省PEDV和PoRVA感染率高且基因型复杂,其中PoRVA存在以G9型、P[13]型为主的流行,优势组合基因型为G9P[13]。本研究丰富了贵州省PEDV和PoRVA的流行病学资料,尤其为PoRVA感染的防控和候选疫苗株的筛选提供了参考数据。

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

A型塞内卡病毒(SVA)是一种新兴的猪病原体,可引起母猪水泡样病变和仔猪急性死亡。本研究将SVA的VP1基因分别克隆到原核表达载体pCold-I和pCold-TF,并将测序正确的重组质粒VP1-pCold-I、VP1-pCold-TF转化BL21(DE3)大肠杆菌中,诱导表达重组蛋白。结果显示:VP1-pCold-I表达的目的蛋白在沉淀(包涵体)中,VP1-pCold-TF表达的蛋白为可溶性蛋白。分别纯化上述表达的蛋白,并免疫BALB/c小鼠,经四次免疫后得到多克隆抗体。经Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定,制备的多克隆抗体具有良好的Western blot效价和IFA效价,为相关基础研究和应用研究提供了工具。

犬源细小病毒兰州株的分离鉴定与VP2基因的遗传进化分析

为了解近年来甘肃省兰州市犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的基因型分布情况及遗传进化方向,于兰州市宠物医院采集8份细小病毒阳性(试纸条检测)的犬粪便样品,使用F81细胞分离病毒;利用PCR、间接免疫荧光试验、血凝试验鉴定所分离的病毒;随后分析病毒基因型和VP2基因的遗传进化关系。结果显示,共分离得到7株细小病毒,1株为New CPV-2a型CPV,5株为CPV-2c型CPV,1株为猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)。VP2氨基酸序列同源性及进化分析结果显示,分离到的CPV-2c型毒株VP2同源性为100%,与北京、江苏等地分离株的亲缘关系较近;New CPV-2a型毒株与吉林、西安等地的分离株亲缘关系较近;犬源猫细小病毒(LZ05)与已报道的FPV毒株相比,存在91S→A、322V→T独特的突变,且与2020年北京一株犬源猫细小病毒分离株亲缘关系最近。

抗传染性法氏囊病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal bursal virus,IBDV)引起的一种高度传染性疾病,以雏鸡法氏囊萎缩、腿肌出血等为特征性病变,给世界家禽产业造成重大经济损失。目前,由新型变异株引起的IBD在我国呈现流行趋势。为建立基于IBDV VP2蛋白的免疫学诊断技术,本研究以新型变异毒株IBDV-LY21/2为模板,扩增其VP2基因,随后构建重组原核表达质粒pCold-Ⅰ-IBDV-VP2并转化BL21(DE3)大肠杆菌进行诱导表达,通过考马斯亮蓝染色和Western blot检测重组蛋白His-VP2的表达情况,并对其进行纯化和浓度测定。将His-VP2免疫BALB/c小鼠后,采用iELISA检测血清抗体效价,最后制备单克隆抗体并对其鉴定。结果显示,获得的重组蛋白His-VP2分子量约为50 kDa,浓度为8 mg/mL;通过两次亚克隆获得3株杂交瘤细胞株1G10F12、3E3E9、4D12G12,且重链均为IgG1型,轻链均为κ型;其中1G10F12、3E3E9可与重组蛋白Myc-VP2产生Western blot和IFA反应,而4D12G12只能与其产生IFA反应。本研究为IBD诊断方法的建立奠定了基础,同时为深入研究VP2蛋白的功能提供生物学工具。

绵羊VPS26A基因克隆、生物信息学及表达谱分析

为获得绵羊液泡蛋白分选26A(Vacuolar Protein Sorting 26A,VPS26A)基因CDS序列,确定其生物学功能,明确其在不同品种不同组织的表达差异,以新吉细毛羊和小尾寒羊为试验动物,以小尾寒羊皮肤组织cDNA为模板通过TA(T's and A's Method)克隆获得CDS区序列,并对序列进行生物信息学分析,预测其可能编码的蛋白质结构和功能;利用实时荧光定量PCR检测VPS26A基因在小尾寒羊和新吉细毛羊不同组织的表达差异。结果显示:VPS26A基因CDS序列全长为981 bp,编码327个氨基酸。绵羊VPS26A氨基酸序列与羚羊相似性最高,同源性为100%,与人的相似性最低,为99.4%;系统进化树结果显示,绵羊VPS26A与山羊和羚羊亲缘关系最近,与人和驴亲缘关系最远。VPS26A蛋白无跨膜结构域和信号肽,存在27个磷酸化位点和2个N-糖基化位点,主要分布在细胞质和核内体上。VPS26A蛋白二级结构预测结果显示,无规则卷曲、延伸链、α螺旋和β转角分别占45.87%、30.28%、18.35%和5.50%,与三级结构预测一致。实时荧光定量PCR结果显示,VPS26A基因在小尾寒羊肺脏中表达量最高,其次是皮肤,而在新吉细毛羊皮肤的表达量均最高,均显著高于其他组织。本研究为进一步阐述VPS26A基因功能奠定了基础。