肺痹方干预肺纤维化小鼠肺泡上皮细胞线粒体途径凋亡的机制

背景:研究表明,线粒体介导的肺泡上皮细胞凋亡在肺纤维化发病中起着重要的作用,而肺痹方可以减轻肺纤维化,抑制肺纤维化小鼠细胞外机制转化。目的:探讨肺痹方对博来霉素致肺纤维化小鼠肺泡上皮细胞线粒体途径凋亡的机制。方法:40只C57BL/6雄性小鼠随机分为空白对照组、模型组、吡非尼酮组、肺痹方组,每组10只。除空白对照组外,其他3组腹腔注射博来霉素[7.5 mg/(kg·d)]建立肺纤维化模型,连续注射10 d。造模后第1天各药物组小鼠灌胃给药[51.43/(kg·d)]吡非尼酮或[12.86 mg/(kg·d)肺痹方],连续给药28 d。用药结束后取材,采用苏木精-伊红染色和Masson染色观察小鼠肺组织的形态学变化,ELISA法检测血清中白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素17、白细胞介素37水平,Western-blot法检测肺组织中Bax、Bcl-2、Beclin-1和Caspase3表达。结果与结论:①肺组织的形态学观察显示,模型组肺泡间隔及肺泡腔有大量炎症细胞浸润,出现大片融合成团的纤维灶;吡非尼酮组肺泡间隔增厚,炎症细胞少量浸润,出现肺纤维灶;肺痹方组肺泡结构增宽,少量的炎症细胞浸润,肺泡结构几乎无明显受损,少量肺纤维灶。②与空白对照组相比,模型组小鼠血清白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素17和白细胞介素37质量浓度明显升高(P<0.01),两用药组明显低于模型组(P<0.01),肺痹方组低于非尼酮组。③与空白对照组相比,模型组小鼠肺组织Bax和Caspase3蛋白表达显著升高,两用药组均低于模型组;与空白对照组相比,模型组Bcl-2和Beclin-1蛋白表达显著降低,两用药组均高于模型组。④结论:肺痹方可以减轻肺纤维化,其机制可能与下调白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素17和白细胞介素37水平,以及调节线粒体凋亡Bax、Bcl-2、Beclin-1和Caspase3相关蛋白从而减少肺泡上皮细胞凋亡有关。

NOD小鼠培育接力赛

2024年第3期本专栏推出的《近交系小鼠培育及其背后的故事》^([1])一文中介绍了实验动物常用近交系小鼠的起源。为了延续这一话题,接下来本专栏将介绍几种具有特殊表型的实验小鼠的培育过程。其中,具有免疫缺陷表型的小鼠无疑是最常用的模式动物之一。虽然裸小鼠和SCID小鼠是最知名的两种自发突变免疫缺陷小鼠,但当下常用的免疫缺陷小鼠如NSG、NOG、NRG和B-NDG?都是以NOD小鼠为背景品系培育而成的^([2])。为更好地了解这些免疫缺陷小鼠,就有必要先了解和掌握NOD小鼠的特性。故本篇将给读者朋友们介绍一下NOD小鼠的主要生物学特性和其曲折的培育史。

羟基红花黄色素A减轻双环己酮草酰二腙小鼠髓鞘脱失的机制

背景:在中枢神经系统脱髓鞘疾病的发生发展过程中,小胶质细胞导致的神经炎症是主要病理特征,因此抑制炎症反应对缓解髓鞘脱失非常重要。羟基红花黄色素A有保护血脑屏障、抑制神经元的凋亡、改善神经功能的作用。目的:探究羟基红花黄色素A抑制双环己酮草酰二腙诱导的小鼠髓鞘脱失的作用机制。方法:①体内实验:将30只健康雄性C57BL/6小鼠随机分为正常组、双环己酮草酰二腙组和羟基红花黄色素A组3组,后2组小鼠喂养含0.2%双环己酮草酰二腙的饲料6周建立脱髓鞘小鼠模型,正常组小鼠喂养正常饲料;在第4周末,给予羟基红花黄色素A组小鼠腹腔注射20 mg/(kg·d)羟基红花黄色素A,正常组和双环己酮草酰二腙组小鼠腹腔注射生理盐水,持续2周。旷场实验、高架十字迷宫实验评价小鼠的行为学变化;黑金染色和髓鞘碱性蛋白、降解髓鞘碱性蛋白免疫荧光染色检测胼胝体髓鞘脱失情况;离子钙结合接头分子1免疫荧光染色和ELISA法分别检测小胶质细胞的活化和炎症因子的表达;Western Blot法检测各组小鼠脑中Toll样受体4、髓样分化因子88、核因子κB p65蛋白的表达水平;②体外实验:采用脂多糖诱导建立BV2小胶质细胞炎症模型。将BV2细胞分为正常组、脂多糖组(1μg/mL)和脂多糖(1μg/mL)+羟基红花黄色素A(25μmol/L)组,采用ELISA法检测细胞上清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达水平。结果与结论:①对比正常组,双环己酮草酰二腙组小鼠焦虑情况严重、自主运动能力异常,胼胝体区髓鞘大量脱失,髓鞘碱性蛋白平均荧光强度显著降低,降解髓鞘碱性蛋白平均荧光强度显著升高,离子钙结合接头分子1阳性小胶质细胞数量增多,脑内白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平升高,Toll样受体4、髓样分化因子88、核因子κB p65的蛋白表达水平明显升高。羟基红花黄色素A治疗后,小鼠上述症状和各项指标均发生相反的变化。②羟基红花黄色素A显著抑制由脂多糖诱导的BV2小胶质细胞炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达。③上述结果说明羟基红花黄色素A能够显著改善双环己酮草酰二腙诱导的小鼠髓鞘脱失,作用机制与Toll样受体4/髓样分化因子88/核因子κB p65信号通路抑制小胶质细胞活化介导的炎症反应有关。

两种肌少症小鼠模型的功能表型、肌肉质量及力量特点比较

背景:地塞米松和后肢悬吊是常用的动物肌少症造模方法,具有造模时间短、操作简便、成本低等特点。目的:比较地塞米松和后肢悬吊诱导小鼠肌少症模型在肌肉质量、力量及功能表型以及分子机制表型方面的差异。方法:采用随机抽样法将30只C57BL/6小鼠随机分成3组,每组10只:正常对照组不进行任何干预;地塞米松组小鼠腹腔注射地塞米松磷酸钠溶液1 mg/(kg•d),连续注射6周,建立肌少症模型;后肢悬吊组采用鼠尾套悬吊小鼠后肢16 h,1次/d,连续悬吊6周,建立肌少症模型。造模6周内,监测小鼠体质量变化;造模6周后,检测小鼠四肢抓力、活动能力(游泳实验)、骨骼肌湿质量、骨骼肌病理形态,采用RT-PCR与Western blot检测骨骼肌蛋白质合成与分解代谢指标、AMPK/FoXO3α信号通路的表达。结果与结论:①从造模后第2周开始,地塞米松组、后肢悬吊组小鼠体质量均低于正常对照组(P<0.05)。②造模6周后,与正常对照组相比,造模两组小鼠四肢抓力均下降(P<0.05),腓肠肌湿质量、趾长伸肌湿质量、腓肠肌与比目鱼肌横截面积均下降(P<0.05);地塞米松组小鼠腓肠肌横截面积明显小于后肢悬吊组(P<0.05),比目鱼肌横截面积大于后肢悬吊组(P<0.05);与正常对照组、后肢悬吊组相比,地塞米松组小鼠活动能力降低(P<0.05)。③与正常对照组相比,造模两组PI3K、mTOR、AMPK、PGC-1αmRNA表达与p-AMPK/AMPK蛋白均降低(P<0.05),FoXO3αmRNA表达与PGC-1α、FoXO3蛋白表达均升高(P<0.05);地塞米松组Akt1 mRNA表达降低(P<0.05),Atrogin-1、MuRF-1 mRNA表达升高(P<0.05);后肢悬吊组Akt1 mRNA表达升高(P<0.05)。④与地塞米松组相比,后肢悬吊组mTOR、Akt1、FoXO3αmRNA表达升高(P<0.05),Atrogin-1、MuRF-1 mRNA表达降低(P<0.05)。⑤结果表明,两种造模方法均会导致骨骼肌线粒体能量代谢水平下降,地塞米松组通过泛素蛋白酶体和能量代谢途径的双重作用介导骨骼肌发生萎缩,后肢悬吊组通过AMPK/FoXO3α信号通路介导能量代谢途径引起骨骼肌发生萎缩,从而引起骨骼肌的质量、力量及功能下降。

过表达神经调节蛋白1的人羊膜间充质干细胞促进小鼠皮肤创面愈合

背景:神经调节蛋白1具有促进细胞增殖、分化以及血管生长等特性。人羊膜间充质干细胞是组织工程领域重要的种子细胞,已被证实参与组织修复及再生过程。目的:构建过表达神经调节蛋白1的人羊膜间充质干细胞,探究其增殖、迁移能力以及对创面愈合的影响。方法:(1)体外分离培养人羊膜间充质干细胞并对其进行鉴定;(2)构建神经调节蛋白1过表达慢病毒,将人羊膜间充质干细胞分为空载组、神经调节蛋白1组、对照组,分别转染空载慢病毒、过表达神经调节蛋白1慢病毒,对照组不进行转染;(3)EdU实验检测各组细胞增殖能力,Transwell实验检测各组细胞迁移能力;(4)构建C57BL/6小鼠创面损伤模型,随机分成对照组、空载组和神经调节蛋白1组,每组8只,分别在创面局部多点均匀注射1 mL转染空载慢病毒或转染过表达神经调节蛋白1慢病毒的人羊膜间充质干细胞,对照组注射等量的生理盐水;(5)造模后1,7,14 d观察创面愈合情况,苏木精-伊红染色观察创面愈合组织学变化,免疫组化观察创面CD31的表达。结果与结论:(1)成功构建过表达神经调节蛋白1的人羊膜间充质干细胞,细胞内神经调节蛋白1的mRNA、蛋白表达较空载组明显上调(P<0.05);(2)过表达神经调节蛋白1促进了人羊膜间充质干细胞的迁移(P<0.01)和增殖(P<0.05);(3)过表达神经调节蛋白1的人羊膜间充质干细胞促进了小鼠创面愈合(P<0.05)和创面的血管生成(P<0.05)。结果表明,过表达神经调节蛋白1提高了人羊膜间充质干细胞的增殖和迁移能力,以及增强了促进创面愈合和创面血管生成的能力。

班氏促卵助孕汤改善多囊卵巢综合征小鼠卵母细胞的质量

背景:班氏促卵助孕汤改善多囊卵巢综合征卵母细胞质量的分子机制亟待完善补充。目的:探讨班氏促卵助孕汤对多囊卵巢综合征小鼠卵母细胞质量的影响和分子机制。方法:21 d龄雌性昆明小鼠颈部皮下注射硫酸脱氢表雄酮构建多囊卵巢综合征模型,连续给药21 d,记录动情周期及妊娠情况,ELISA检测血清性激素水平,Annexin V染色检测卵母细胞凋亡率,DCFH-DA荧光探针检测卵母细胞内活性氧水平,免疫荧光法观察卵母细胞纺锤体及染色体情况,网络药理学及分子对接验证班氏促卵助孕汤核心有效成分与卵母细胞成熟相关因子(生长分化因子9和骨形态发生蛋白15)结合活性,实时荧光定量PCR和Western blot检测卵母细胞中生长分化因子9和骨形态发生蛋白15的mRNA及蛋白表达水平。结果与结论:①班氏促卵助孕汤中的成分(槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇)与生长分化因子9、骨形态发生蛋白15具有良好的结合活性;②班氏促卵助孕汤能恢复小鼠动情期,改善性激素紊乱和妊娠情况,降低细胞凋亡率、活性氧水平、纺锤体组装异常率、染色体丢失率(P<0.01,P<0.05),促进生长分化因子9、骨形态发生蛋白15 mRNA和蛋白表达(P<0.01,P<0.05)。结果表明,班氏促卵助孕汤可能通过调控生长分化因子9和骨形态发生蛋白15的基因表达,改善多囊卵巢综合征小鼠卵母细胞质量,提高生育力。

年轻和老年小鼠脂肪来源干细胞生物学特性对比

背景:脂肪来源干细胞具有抗衰老的作用,但来自不同年龄供者的脂肪来源干细胞是否有区别,还需深入研究。目的:对比老年和年轻小鼠脂肪来源干细胞的生物学特性。方法:分别从8周龄、14周龄C57BL小鼠脂肪组织中提取脂肪来源干细胞,对比分析老年和年轻小鼠脂肪来源干细胞的细胞周期、凋亡、增殖能力的差异,定量PCR和Western blot检测老年和年轻小鼠脂肪来源干细胞衰老相关P21、P27基因和蛋白的表达。结果与结论:与老年小鼠脂肪来源干细胞相比,年轻小鼠脂肪来源干细胞更有活力,形态更规则,凋亡更少,增殖更快,衰老相关P21、P27基因和蛋白表达量更低,说明年轻小鼠脂肪来源干细胞具有更好的抗衰老作用。

基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠

背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/-)小鼠;将Sftpc-Cre^(+/+)小鼠与野生型小鼠交配获得更多的Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。将Sftpc-Cre^(+/+)或子代Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/-)或子代SENP1^(flox/flox)小鼠进行杂交,获得SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)双杂合小鼠。将SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/flox)小鼠杂交,获得SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。剪鼠尾提取基因组DNA,行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定小鼠基因型。取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织行免疫荧光双标实验及Western blot以验证SENP1敲除效果;取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠心、肝、肺、肾组织行苏木精-伊红染色以观察两组小鼠各脏器的组织形态。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳正确筛选出SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。免疫荧光双标实验显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1的平均荧光强度降低(P<0.01),且SENP1和Sftpc未见明显共定位(P<0.01)。Western blot结果显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1蛋白表达降低(P<0.001)。苏木精-伊红染色结果显示SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠的心、肝、肺和肾脏组织形态无明显改变。该研究利用Cre-loxP重组酶系统成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠,为后续研究SENP1基因在以肺泡Ⅱ型上皮细胞为主要损伤细胞的肺疾病如支气管肺发育不良、特发性肺纤维化中的作用提供了良好的工具。

成年小鼠触液神经元体外分离培养及自我更新能力的鉴定

背景:课题组前期成功在体外分离培养乳鼠触液神经元,尚无研究报道有效分离培养高纯度成年小鼠触液神经元的方法,且触液神经元的自我更新能力是否随着年龄发生变化尚无研究。目的:建立一种高纯度成年小鼠触液神经元体外分离培养的方法,并鉴定成年小鼠触液神经元与乳鼠触液神经元在体外的自我更新能力。方法:从成年3月龄小鼠颈髓分离含有触液神经元的原代细胞贴壁培养并利用融合多模态成像基因的慢病毒转染细胞,通过嘌呤霉素筛选得到高纯度成年小鼠触液神经元细胞,在完全培养基中悬浮培养。通过免疫荧光检测成年小鼠触液神经元表达神经干细胞标记物巢蛋白(Nestin)及SOX2情况,观察成年小鼠触液神经元体外成球与传代能力;将同等数量(5×10^(3))的第3代成年小鼠及乳鼠触液神经元在同等条件下分为2组,分别接种在含有完全培养基的超低黏附培养板中,在体积分数5%CO_(2),37℃恒温箱悬浮培养,通过体外成球、CCK8实验、qPCR和Western blot鉴定成年小鼠及乳鼠触液神经元的自我更新能力。结果与结论:①实验成功在成年小鼠体内分离出高纯度触液神经元,在体外表达Nestin及SOX2,能形成神经球并连续传代。②成年小鼠触液神经元体外自我更新能力较乳鼠相比明显减弱,细胞培养到第4天时乳鼠触液神经元已经形成直径约为150μm的神经球,而成年小鼠触液神经元所形成的神经球直径仅为40μm(P<0.0001)。③CCK8增殖实验结果表明,成年小鼠触液神经元的增殖活性在培养后各时间点显著弱于乳鼠(P<0.0001)。④qPCR和Western blot检测发现成年小鼠触液神经元Nestin及SOX2的mRNA(P<0.0001)和蛋白表达量(P<0.01)较乳鼠显著下降。⑤上述结果证实,成年小鼠触液神经元的体外自我更新能力显著弱于乳鼠。

茯苓酸对小鼠黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制研究

目的:研究茯苓酸(pachymic acid,PA)对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其可能机制。方法:采用CCK8法和细胞克隆形成实验检测不同浓度(20、40、80μmol/L)PA对B16细胞增殖的影响;细胞划痕和Transwell小室实验观察PA对B16细胞迁移和侵袭能力的影响;Western Blot法和免疫荧光法检测PA对B16细胞的上皮-间质转化相关蛋白表达的变化。结果:PA可以明显抑制B16细胞增殖,并呈一定的浓度依赖性关系(P<0.01);PA干预24 h后可以显著抑制B16细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01);40μmol/L的PA能上调B16细胞的E-cadherin蛋白表达(P<0.05)并下调Vimentin蛋白的表达(P<0.05);免疫荧光法检测显示40μmol/L的PA可明显降低B16细胞Vimentin蛋白的表达。结论:PA可以抑制B16细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制可能与上调B16细胞的E-cadherin蛋白表达,降低Vimentin蛋白表达,从而抑制B16细胞的上皮-间质转化有关。

三种小鼠肠道病毒多重PCR检测方法的建立和初步应用

目的建立一种同时检测小鼠细小病毒(MVM)、肝炎病毒(MHV)和诺如病毒(MNV)的多重PCR检测方法。方法分别根据MVM、MHV和MNV基因保守区应用软件设计特异性引物,构建在同一反应体系中可同时检测MVM、MHV和MNV的多重PCR检测方法,验证其特异性、敏感性及重复性,并进行初步检测应用。结果通过优化PCR扩增条件成功建立多重PCR检测方法,特异性实验结果表明,该方法可同时扩增MVM、MHV和MNV的目的片段,片段大小与预期相符,未出现非特异性片段;敏感性测试显示,MVM、MHV和MNV三种病毒的最低检测下限为10^(2)、10^(4)、10^(2) copies/μL;重复性实验显示该方法在不同时间、不同场所应用的重复性稳定。应用该方法对287份小鼠结肠匀浆样品进行检测,与单重PCR检测结果完全一致。结论所建立的MVM、MHV和MNV三种病毒多重PCR检测方法具有特异性高、敏感性强和重复性优的特点,适用于三种病原体感染的临床样品检测和大量样品的流行病学调查。

BD-77雾化吸入给药对肺炎支原体感染小鼠的治疗作用

目的评价BD-77雾化吸入给药对肺炎支原体肺炎小鼠模型的治疗作用。方法Balb/c小鼠按照体质量随机分为正常对照组、模型对照组、阿奇霉素对照组(42 mg·kg^(-1)·d^(-1))、BD-77高剂量组(75 mg·mL^(-1),雾化15 min)、BD-77低剂量组(37.5 mg·mL^(-1),雾化15 min)。以肺炎支原体滴鼻感染建立小鼠支原体肺炎模型,雾化给药4 d后,通过小鼠体重及肺重计算肺指数和肺指数抑制率,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肺组织中白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量及血清中C反应蛋白(CRP)水平,苏木精-伊红(HE)染色评估小鼠肺组织病理学变化,全面评价BD-77对小鼠支原体肺炎的治疗作用。结果BD-772个剂量组雾化吸入给药15 min均可显著降低小鼠肺指数,减轻肺部炎症病变,降低肺组织中IL-6、IL-1β、TNF-α含量及血清CRP水平。结论BD-77雾化吸入可治疗支原体感染小鼠肺炎,本研究为BD-77开发作为防治肺炎支原体肺炎的药物提供了实验室数据支持。

基于免疫调节探讨葛根汤颗粒治疗小鼠病毒性肺炎的作用机制

目的研究葛根汤颗粒对甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)致小鼠病毒性肺炎模型的药效评价及免疫调节作用。方法ICR小鼠,13~15 g,分为正常对照组、模型对照组,磷酸奥司他韦阳性药对照组及葛根汤颗粒高、中、低剂量组(6.6、3.3、1.7 g-1·kg^(-1)·d^(-1)),每组10只,采用IAV(FM1株)病毒液感染建立小鼠病毒性肺炎模型,同时给予相关药物治疗。观察各组小鼠肺指数及肺指数抑制率,RT-PCR法检测肺组织核酸,ELISA法检测小鼠肺组织因子白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子TNF-α;同时采用IAV(FM1株)病毒液滴鼻感染小鼠,造成死亡保护模型,观察小鼠感染后2周内的死亡情况,计算小鼠的死亡率、死亡保护率、平均存活天数和生命延长率。结果葛根汤颗粒中剂量组肺指数及肺组织病毒载量显著降低(P<0.01),肺指数抑制率为50.73%;葛根汤颗粒高、中剂量组肺组织炎性因子IL-10含量显著降低(P<0.01)、葛根汤颗粒中、低剂量组肺组织炎性因子TNF-α含量显著降低(P<0.01);葛根汤颗粒3个剂量组肺组织炎性因子IL-6含量显著降低(P<0.01);模型组小鼠死亡率90%,平均存活天数9.45 d,葛根汤颗粒3个剂量组小鼠死亡率显著降低、平均存活天数显著延长,生命延长率显著提高(P<0.01)。结论葛根汤颗粒可通过调节模型小鼠免疫炎性因子水平达到改善病毒性肺炎小鼠免疫功能的作用,同时可显著降低模型小鼠肺指数和肺组织病毒载量,从而减轻模型小鼠的肺部炎性损伤;对模型小鼠有死亡保护作用。

苍术酮通过调节Nrf2-NLRP3通路减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤实验研究

目的研究苍术酮调节核因子NF-E2相关因子(Nrf2)-NLRP3通路对LPS诱导急性肺损伤(ALI)小鼠的保护作用。方法构建ALI小鼠模型,实验分为对照组、模型组、地塞米松组及苍术酮低、中、高剂量组。ELISA测定各组小鼠血清及肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)水平;通过测定肺组织湿/干质量比重(W/D),评估其水肿程度,检测肺组织抗髓过氧化物酶抗体(MPO)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)超氧化物歧化酶(SOD)及丙二酮(MDA)含量以评估其体内抗氧化损伤的作用;HE染色法检查肺损伤情况,并进行评分;RT-qPCR测定各组小鼠肺组织Nrf2、HO-1、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA水平。结果苍术酮对LPS诱导的小鼠ALI具有较好的保护作用,可降低小鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平和W/D比值、肺组织MPO、MDA及NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA水平,提高血清IL-10水平及肺组织GSH-Px、SOD及Nrf2、HO-1 mRNA水平,明显改善肺组织学病理表现,降低肺组织病理评分,且呈剂量依赖性(P<0.05)。结论苍术酮可通过调节炎症因子及氧化应激以缓解ALI小鼠肺损伤,其机制可能与调节Nrf2-NLRP3通路有关。

基于YOLO v8n-seg和改进Strongsort的多目标小鼠跟踪方法

多目标小鼠跟踪是小鼠行为分析的基本任务,是研究社交行为的重要方法。针对传统小鼠跟踪方法存在只能跟踪单只小鼠以及对多目标小鼠跟踪需要对小鼠进行标记从而影响小鼠行为等问题,提出了一种基于实例分割网络YOLO v8n-seg和改进Strongsort相结合的多目标小鼠无标记跟踪方法。使用RGB摄像头采集多目标小鼠的日常行为视频,标注小鼠身体部位分割数据集,对数据集进行增强后训练YOLO v8n-seg实例分割网络,经过测试,模型精确率为97.7%,召回率为98.2%,mAP50为99.2%,单幅图像检测时间为3.5 ms,实现了对小鼠身体部位准确且快速地分割,可以满足Strongsort多目标跟踪算法的检测要求。针对Strongsort算法在多目标小鼠跟踪中存在的跟踪错误问题,对Strongsort做了两点改进:对匹配流程进行改进,将未匹配上目标的轨迹和未匹配上轨迹的目标按欧氏距离进行再次匹配;对卡尔曼滤波进行改进,将卡尔曼滤波中表示小鼠位置和运动状态的小鼠身体轮廓外接矩形框替换为以小鼠身体轮廓质心为中心、对角线为小鼠体宽的正方形框。经测试,改进后Strongsort算法的ID跳变数为14,MOTA为97.698%,IDF1为85.435%,MOTP为75.858%,与原Strongsort相比,ID跳变数减少88%,MOTA提升3.266个百分点,IDF1提升27.778个百分点,与Deepsort、ByteTrack和Ocsort相比,在MOTA和IDF1上均有显著提升,且ID跳变数大幅降低,结果表明改进Strongsort算法可以提高多目标无标记小鼠跟踪的稳定性和准确性,为小鼠社交行为分析提供了一种新的技术途径。

成纤维细胞生长因子受体1,2在小鼠肾发育中的动态表达

背景:在肾发育过程中,成纤维细胞生长因子受体1,2的时空表达仍是一个有争议的问题,且其与肾脏发育的关系尚不清楚。目的:观察成纤维细胞生长因子受体1,2在小鼠肾发育过程中的动态表达,探求它们与肾发生发育的关系。方法:培育不同发育阶段的胎鼠(E12,14,16,18 d)和仔鼠(N1,3,7,14,24,40 d),应用免疫组织化学技术观察成纤维细胞生长因子受体1,2在不同肾组织中的时空表达,结合体视学和Western blot对它们的表达进行定量分析。结果与结论:①免疫组化显示:在E12 d时,成纤维细胞生长因子受体1主要定位在输尿管芽尖端的生后肾组织,随后表达在各期未成熟的肾小体、部分远曲小管和毛细血管袢,反应部位主要集中在生肾区;而成纤维细胞生长因子受体2开始即在输尿管芽和生后肾组织中均有表达,随着后肾发育,定位于未发育成熟的各期肾小体、远端小管、集合管和髓袢细段,成熟肾小体表达微弱;②体视学和Western blot检测显示:成纤维细胞生长因子受体1在生前表达较高,出生后逐渐下降,N7 d后表达很低;成纤维细胞生长因子受体2在肾脏的表达随着胚(日)龄的增加而升高,N7 d后趋于稳定;③结果表明:在肾的发育过程中,成纤维细胞生长因子受体1,2呈一定的时空性表达,推测二者可能参与了肾单位的发育与成熟,而在输尿管芽分支和形态的形成过程中,成纤维细胞生长因子受体2的作用更为显著。

姜黄素对小鼠小肠上皮细胞氧化应激损伤的保护作用及机制研究

本试验旨在研究姜黄素对小鼠小肠上皮细胞(MODE-K细胞)氧化应激损伤的保护作用及机制。使用过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导小鼠小肠上皮细胞,建立细胞氧化损伤模型,并确定最佳造模H_(2)O_(2)浓度。对照组使用正常培养液培养细胞,不进行任何处理;模型组使用正常培养液培养细胞后,加入H_(2)O_(2)处理细胞4 h;姜黄素组使用正常培养液培养细胞后,先加入不同浓度(1.25、2.50、5.00、10.00和20.00μmol/L)的姜黄素处理细胞12 h,然后再加入H_(2)O_(2)处理细胞4 h。测定小鼠小肠上皮细胞存活率、凋亡率以及细胞中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量和乳酸脱氢酶(LDH)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,实时荧光定量PCR检测B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤相关X蛋白(Bax)、半胱天冬蛋白酶-3(Caspase-3)的mRNA相对表达水平,利用分子模拟研究姜黄素与Kelch样环氧氯丙烷关联蛋白1(Keap1)口袋结合的优势构象和相互作用,蛋白质印迹(Western blot)检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、Keap1、血红素加氧酶-1(HO-1)的蛋白相对表达水平。结果表明:1)最佳造模H_(2)O_(2)浓度为150μmol/L。2)与对照组相比,模型组的细胞存活率及细胞中SOD、GSH-Px活性显著降低(P<0.05),细胞中ROS、MDA含量和LDH活性显著增加(P<0.05)。与模型组相比,5.00~20.00μmol/L姜黄素组的细胞存活率及细胞中SOD、GSH-Px活性显著增加(P<0.05),细胞中ROS、MDA含量和LDH活性显著降低(P<0.05)。3)与对照组相比,模型组的细胞凋亡率显著增加(P<0.05),细胞中Bcl-2的mRNA相对表达水平显著降低(P<0.05),Bax和Caspase-3的mRNA相对表达水平显著提高(P<0.05)。与模型组相比,10.00μmol/L姜黄素组的细胞凋亡率显著降低(P<0.05),细胞中Bcl-2的mRNA相对表达水平显著提高(P<0.05),Bax和Caspase-3的mRNA相对表达水平显著降低(P<0.05)。4)分子对接结果表明,姜黄素通过与Keap1的Kelch结构域结合位点相互作用,成功阻止了Keap1-Nrf2之间的相互作用,从而发挥了抗氧化的作用。Western blot结果进一步表明,与模型组相比,10.00μmol/L姜黄素组的细胞中Nrf2、HO-1的蛋白相对表达水平显著提高(P<0.05),Keap1的蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05)。由此可见,适宜浓度(10.00μmol/L)的姜黄素可通过促进Nrf2/HO-1信号通路中Nrf2和HO-1的蛋白表达,抑制Keap1的蛋白表达,减轻H_(2)O_(2)诱导的小鼠小肠上皮细胞的氧化损伤。

有氧运动抑制炎症反应改善ApoE^(-/-)动脉粥样硬化小鼠心肌纤维化机制研究

背景动脉粥样硬化(AS)会引发心肌梗死、心肌纤维化等心血管病变,随着全球人口老龄化加重,发病人群逐渐增多。炎症反应是心肌纤维化的关键因素,规律的有氧运动可以减轻炎症保护心肌功能。但有氧运动对AS心肌纤维化的保护机制尚不清楚。目的本研究旨在探讨有氧运动对AS小鼠心肌纤维化的影响机制。方法2022年2—8月选取27只8周龄的雄性ApoE^(-/-)小鼠作为实验对象,将小鼠随机分为对照组、模型组和有氧运动组,每组9只。制备AS小鼠模型,对小鼠进行运动训练,Masson染色、苏木素-伊红(HE)染色观察心肌组织情况,蛋白质印迹法(Western blotting)检测心肌组织NOD受体3(NLRP3)、白介素1β(IL-1β)、转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白表达情况,检测超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)表达量。结果Masson染色结果示模型组心肌组织纤维化较对照组明显加重;有氧运动组心肌组织纤维化较模型组明显改善。HE染色结果示模型组小鼠心肌细胞排列较错乱,细胞形态、大小异常,细胞间隙增大,存在炎性细胞浸润;有氧运动组小鼠心肌细胞排列尚整齐,细胞形态、大小异常,细胞间隙基本正常。模型组NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表达高于对照组,有氧运动组NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表达低于模型组、高于对照组(P<0.05)。模型组SOD、GSH-Px表达量低于对照组,有氧运动组SOD、GSH-Px表达量高于模型组、低于对照组(P<0.05)。结论有氧运动明显改善ApoE^(-/-)AS小鼠心肌纤维化,其机制可能与抑制心肌炎性反应、激活抗氧化水平有关。

甘草酸能减轻小鼠肺炎病毒引起的小鼠肺脏损伤

目的通过小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice,PVM)感染近交系BALB/c小鼠建立病毒感染肺炎动物模型,观察PVM感染过程中促炎症警报素分子高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)的变化,以及HMGB1抑制剂甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)对小鼠肺脏感染损伤的在体干预作用。方法将3周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为3组,每组6只。一组未经PVM感染,作为对照组(Control);另外两组先以1×10^(4)半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID_(50))/25μL剂量滴鼻接种PVM,然后分别给予GA生理盐水溶液灌胃(GA组)或单纯生理盐水灌胃(normal saline,NS组)处理,连续15 d。其间,观察并记录各组小鼠体重、外观等改变。在实验终点采集各组小鼠的肺脏组织样本,通过苏木精-伊红染色和免疫组织化学法检测小鼠肺脏组织内PVM和HMGB1蛋白的分布情况;通过实时荧光定量PCR法检测小鼠肺脏组织中HMGB1、Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR-4)、晚期糖基化终产物特异性受体(advanced glycosylation end-product-specific receptor,AGER),以及白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-2和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎症因子的表达水平。结果与Control组相比,NS组小鼠6 d后体重显著下降(P<0.05),组织病理学结果显示其肺脏有明显的炎症病变,免疫组织化学结果显示HMGB1从细胞核释放至细胞质,实时荧光定量PCR结果显示HMGB1、IL-1β和IL-2的表达水平均显著上调(P<0.05);GA干预组的临床症状和体重无明显变化。而与NS组相比,GA干预组肺组织的病理损伤明显减轻,且肺组织中HMGB1、IL-1β、IL-2和干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)的表达水平显著下降(P<0.05),但AGER的表达水平显著增高(P<0.05)。结论PVM感染能引起明显的小鼠肺部炎症性病理损伤,而GA能有效减轻其损伤,其作用机制可能与激活HMGB1信号通路相关。

马里苷对糖尿病小鼠肝脏和胰腺组织形态及自噬的影响

目的:探讨马里苷对糖尿病小鼠肝脏、胰腺的组织形态以及自噬调节的影响。方法:选择10只db/m小鼠为对照组,按照随机对照原则将另外30只db/db小鼠分为模型组、二甲双胍阳性药组和马里苷给药组,每组10只。各组连续灌胃给药8周,HE染色观察各组小鼠肝脏和胰腺的形态学变化、免疫组化检测小鼠肝脏P62的含量、Western Blotting检测小鼠肝脏自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、ATG5和Beclin1的表达水平。结果:组织形态学显示,二甲双胍和马里苷给药组小鼠肝小叶结构较清晰,肝索排列较紊乱,肝细胞气球样变有所减轻,且胰岛形态较正常,边界比较清晰,胰岛细胞排列有明显改善,胰岛细胞空泡状变性减少。肝脏免疫组化结果显示,模型组小鼠P62表达高于对照组,二甲双胍阳性药组和马里苷给药组使病理状态下P62的表达明显降低。蛋白免疫印迹结果显示,与模型组比较,马里苷和二甲双胍可以显著增加糖尿病小鼠肝脏自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、ATG5和Beclin1的表达(P<0.05),降低P62的表达(P<0.05)。结论:马里苷可缓解糖尿病所造成的肝脏和胰腺的组织病理损伤;促进糖尿病小鼠肝脏自噬表达增强。