裂谷热病毒截断的Gn蛋白在E.coli中的表达与多克隆抗体的制备

目的为避免作为中和试验病原的裂谷热病毒(RVFV)存在生物安全隐患,探索建立RVFV假病毒中和试验方法.方法利用pET-30a原核表达载体,构建重组质粒含有截短的Gn蛋白片段,转化BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达目的蛋白通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),表达蛋白的正确与否通过SDS-PAGE和Western Blotting检测,纯化表达蛋白通过带his标签的镍柱.将RVFV Gn蛋白纯化后免疫小鼠,抗体效价通过ELISA检测,多克隆抗体对G蛋白的特异性通过Western Blotting检测.结果成功获得表达目的蛋白,RVFV Gn蛋白纯化后诱导小鼠产生的Gn多克隆抗体水平较高,并且多克隆抗体对G蛋白的特异性较强.结论利用PET30a载体构建了可表达RVFV截短的Gn蛋白的大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),并且制备的多抗对全长G蛋白的特异性较好,将蛋白纯化免疫Balb/c小鼠,经ELISA检测制备的多克隆抗体,抗体滴度较高.

龙陵黄山羊羊源E.coli ClpV1基因缺失株构建及部分生物学特性分析

为了探讨龙陵黄山羊羊源E.coli ClpV1基因对E.coli部分生物学特性的影响,试验以腹泻龙陵黄山羊肛门拭子为病料进行细菌分离鉴定;从分离菌中挑选对卡那霉素和大观霉素均敏感的原菌株E.coli D1,运用CRISPR/Cas9技术构建缺失株E.coliΔClpV1-D1;连续传15代后运用PCR方法检测缺失株E.coliΔClpV1-D1遗传稳定性;挑取原菌株E.coli D1与缺失株E.coliΔClpV1-D1单克隆接种于LB液体培养基中培养,在24 h内每隔1 h测定其生长速度;30℃培养72 h后采用结晶紫染色法测定原菌株E.coli D1与缺失株E.coliΔClpV1-D1生物被膜形成能力;采用MTT法测定原菌株E.coli D1与缺失株E.coliΔClpV1-D1在第3,6,9,12小时时的细胞存活率;分别取1.0×10^(5)cfu/mL、1.0×10^(8)cfu/mL浓度的原菌株E.coli D1与缺失株E.coliΔClpV1-D1对昆明小鼠进行腹腔注射,24 h后记录各组小鼠死亡数量,进行致病性分析。结果表明:从16份肛门拭子病料中分离得到12株E.coli;运用CRISPR/Cas9技术成功构建出缺失株E.coliΔClpV1-D1;缺失株E.coliΔClpV1-D1连续传15代后仍能稳定遗传;原菌株E.coli D1和缺失株E.coliΔClpV1-D1在24 h内生长速度无显著差异(P>0.05);缺失株E.coliΔClpV1-D1的生物被膜形成能力显著低于原菌株E.coli D1(P<0.05);在测定的4个时间段缺失株E.coliΔClpV1-D1对IPEC-J2细胞毒性减弱,两种浓度的缺失株对小鼠的致死率均显著低于原菌株(P<0.05)。说明缺失ClpV1基因对E.coli生长速度无明显影响,但会降低其生物被膜形成的能力和致病性。

重组体pET-28a-alkB/E.coli降解页岩油泥石油烃的功能研究

为了降解页岩油泥中的石油烃,构建基因工程菌,表达石油烃降解关键酶以提高油泥的降解效果。以Pseudomonas qingdaonensis基因组为模板扩增alkB基因,连接至载体pET-28a,转化至E.coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE和Western-blot鉴定表达的外源蛋白。pET-28a-alkB/E.coli处理原油和页岩油泥,采用气相色谱法评估降解效果。发现alkB基因在大肠杆菌中能表达外源蛋白,且14 d原油及页岩油泥的降解率分别为47.5%和47.1%,表明重组体pET-28a-alkB/E.coli具备降解页岩油泥石油烃的功能。

基于dsDNA-CuNCs的荧光ELISA检测牛奶中的E.coli O157:H7

目的:建立了一种灵敏检测牛奶中大肠杆菌O157:H7的新型荧光酶联免疫吸附方法。方法:以碱性磷酸酶水解焦磷酸盐-Cu^(2+)配位复合物,释放出Cu^(2+)形成铜纳米簇作为信号报告探针,通过对关键因素Cu^(2+)浓度、焦磷酸盐浓度、DNA模板的浓度和长度进行优化。结果:在最优条件下,大肠杆菌O157:H7的菌数为5×10^(4)~1×10^(8)CFU/mL时,与荧光信号值有较好的线性关系(R^(2)=0.9808),最低检出限为2.4×10^(4)CFU/mL。结论:该方法成功地应用于低脂牛奶和脱脂牛奶样本中大肠杆菌O157:H7的测定,平均回收率为92.2%~10^(8).5%,相对标准偏差为4.9%~10.4%。

小檗碱消除ESBLs大肠杆菌耐药性的研究

为了研究小檗碱消除超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠杆菌耐药性的效果,试验以3株ESBLs大肠杆菌作为研究对象,采用二倍稀释法测定小檗碱作用3株ESBLs大肠杆菌前后的MIC变化,然后采用琼脂糖凝胶电泳、ELISA法和实时荧光定量PCR方法分别检测小檗碱作用后大肠杆菌R质粒、ESBLs活性、生物被膜形成及外排系统AcrA mRNA、AcrB mRNA转录水平的变化。结果表明:3株ESBLs大肠杆菌对小檗碱的MIC均为2.00 mg/mL;经小檗碱作用后有2株ESBLs大肠杆菌对头孢噻肟的MIC从32.00 mg/mL降至8.00 mg/mL,有1株ESBLs大肠杆菌对头孢噻肟的MIC从32.00 mg/mL降至16.00 mg/mL。经小檗碱作用后有2株ESBLs大肠杆菌质粒条带消失2条,有1株ESBLs大肠杆菌质粒条带消失1条;3株ESBLs大肠杆菌的ESBLs活性均极显著降低(P<0.01),碱性磷酸酶活性均极显著升高(P<0.01);3株ESBLs大肠杆菌外排系统AcrA mRNA转录水平极显著降低(P<0.01),2株ESBLs大肠杆菌外排系统AcrB mRNA转录水平显著降低(P<0.05)。说明小檗碱对ESBLs大肠杆菌的4种耐药消除机制均具有良好的效果。

Fe_(3)O_(4)@CTAC粒子的制备及抗菌性能研究

采用溶剂热法合成了分散性良好的Fe_(3)O_(4)粒子,然后将油酸修饰到Fe_(3)O_(4)粒子表面,再通过疏水作用进行十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)包覆,得到Fe_(3)O_(4)@CTAC粒子。采用扫描电子显微镜(SEM)、X射线光电子能谱(XPS)、X射线衍射(XRD)、Zeta电位和振动样品磁强计(VSM)对Fe_(3)O_(4)@CTAC粒子进行了表征,结果表明:Fe_(3)O_(4)粒子表面包覆CTAC后粒径无明显变化,并且仍保持良好的单分散性;Fe_(3)O_(4)@CTAC粒子具有超顺磁性和良好的磁响应性能;Fe_(3)O_(4)@CTAC粒子的Zeta电位较高,分散体系具有较好的稳定性。对Fe_(3)O_(4)@CTAC粒子进行了抗菌性能及磁分离去除菌体测试,结果显示:当Fe_(3)O_(4)@CTAC粒子的含量为50 mg/mL时,与大肠杆菌(E.coli)(105cfu/mL)作用10 min,抗菌率可达100%;Fe_(3)O_(4)@CTAC粒子对E.coli、金黄色葡萄球菌(S.aureus)及枯草芽孢杆菌(B.subtilis)均具有良好的抗菌效果;通过磁场分离可以将Fe_(3)O_(4)@CTAC粒子及吸附的菌体去除。以上结果表明Fe_(3)O_(4)@CTAC粒子是一种快速、高效、可以实现无菌体残留的抗菌剂,具有潜在的应用价值。

大肠杆菌烈性噬菌体vB_EcoM_JN03的分离、鉴定及其抑菌效果研究

【目的】大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)是一种重要的食源性致病菌。抗生素的不当使用导致E.coli O157:H7多重耐药和泛耐药成为一个日益严重的问题,研究其天然杀菌剂——烈性噬菌体,对于防控多重耐药E.coli O157:H7污染具有理论意义和实践应用价值。【方法】以多重耐药E.coli O157:H7为宿主菌,采用双层琼脂平板法,从污水中分离烈性噬菌体,对其生物学特性进行表征和全基因组序列分析,并评价该噬菌体应用于食品中对E.coli O157:H7的抑菌效果。【结果】成功分离纯化了一株可裂解E.coli O157:H7的噬菌体,命名为vB_EcoM_JN03(GenBank登录号:OR885871)。vB_EcoM_JN03属于有尾噬菌体目,肌尾病毒科;其最佳感染复数(MOI)为0.01,潜伏期为30 min,120 min后到达平稳期,裂解量80 PFU/cell;其在30~60℃和pH 4~12范围内效价稳定。vB_EcoM_JN03的基因组为双链DNA,全长158142 bp,G+C含量44.63%,编码206个开放阅读框(ORF),不含已知编码的毒力、抗生素耐药和溶源性基因。vB_EcoM_JN03在4℃下可显著抑制牛奶和牛肉样品中污染的E.coli O157:H7。【结论】经分离、鉴定的E.coli O157:H7烈性噬菌体vB_EcoM_JN03对宿主菌具有良好的抑制作用,有望作为一种天然杀菌剂防控E.coli O157:H7污染食品。

羊腹泻大肠杆菌整合子及ESBLs携带情况检测

为了确定内蒙古自治区羊腹泻大肠杆菌的耐药机制,本试验采用PCR方法检测呼和浩特市周边牧场分离菌株中整合酶基因(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型)、耐药基因盒和编码超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因的携带情况。结果显示,108株羊腹泻大肠杆菌中,Ⅰ型整合酶基因和耐药基因盒插入区扩增呈阳性的菌株为42株,检出率为38.9%,未检出Ⅱ、Ⅲ型整合酶基因;菌株中有5类基因盒流行,主要携带甲氧苄氨嘧啶(dfr)和氨基糖苷类(aadA)耐药基因;分离菌株的bla_(TEM)基因检出数为83株,占比76.9%,bla SHV和bla_(CTX)基因PCR扩增均为阴性;质粒DNA上成功扩增出携带bla TEM型ESBLs基因的Ⅰ型整合子阳性菌株40株。结果表明,内蒙古自治区羊腹泻大肠杆菌Ⅰ型整合子的携带率较高,菌株对磺胺类、甲氧苄氨嘧啶和氨基糖苷类药物的耐受性与其携带的耐药基因盒密切相关,分离菌株中ESBLs的产生和传播由菌株自身质粒所介导,这可能是其对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要原因,且Ⅰ型整合子在ESBLs阳性菌株中的广泛分布,也使得菌株携带的耐药基因更易散播。本试验通过对羊腹泻大肠杆菌耐药性的产生和传播进行分析,以指导临床合理用药。

梅花鹿源大肠杆菌ESBLs基因型检测与分析

为分析黑龙江省梅花鹿源产超广谱β-内酰胺类酶(ESBLs)大肠杆菌耐药基因的分布情况,为临床抗微生物药的合理使用提出指导意见。从黑龙江省4个养殖场中分离出130株梅花源大肠杆菌,采用K-B纸片法,结果显示对诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星的耐药率达到10%以上。采用PCR技术对ESBLs基因进行检测。结果显示,耐药基因OXA、TEM的检出率分别为13.85%(18/130)、76.15%(99/130),CTX-M和SHV均未检出。4个养殖场的ESBLs基因以TEM为主。

不同猪种E .coli F1 8受体基因的多态性

采用PCR RFLP技术检测了大约克、长白、杜洛克、宁乡、沙子岭和大围子 6个品种共 86 7头猪的E .coliF18受体 (ECF18R)基因座的遗传变异。结果表明 :Hin6Ⅰ RFLP位点上 ,大约克、长白、杜洛克 3个外来猪种均存在多态 ,且以敏感型 (GG型和AG型 )居多 ,平均占 94%,3个外来猪种的G等位基因频率平均为 0 76 ,AA抗性型个体占少数 ,平均为 6 %,猪群中M30 7处G→A的突变频率并不高。宁乡、沙子岭和大围子 3个本地猪种的所有检测样品都表现为GG型 ,在该位点上均不存在G→A的突变。各猪种ECF18受体基因座的PCR RFLP基因型分布 χ2 检验结果表明 ,每个外来猪种ECF18受体基因座的PCR RFLP基因型分布与 3个本地猪种的相比均差异显著或极显著 ,3个本地猪种间的ECF18受体基因座的PCR RFLP基因型分布完全一致。外来猪种间只有长白与杜洛克各基因型的分布差异显著 ,其余均不显著。

重组E.coli工程菌高密度培养生产人源型胶原蛋白

Several technical parameters were studied during the fermentation of recombinant E.coli for the production of collagen-like biopolymer.The effects of dissolved oxygen as well as glucose concentration on fermentation were observed.The OD 600 value could reach 98 when dissolved oxygen was controlled at 50% and glucose around 1%.The production of human-like collagen with a yield of 29.4% was obtained.

四川规模化猪场仔猪黄、白痢E.coli的分离鉴定

从四川省 17个规模化猪场发生典型仔猪黄、白痢猪的肛拭粪样及死亡猪的心血和肝脏中分离鉴定出 2 45株致病性大肠肝菌 ,用 35种大肠杆菌O抗原单价血清进行了血清学鉴定。结果表明 :2 45株分离菌有 172株能定型 ,分属 30种血清型 ,其中以 0 60 (13.3% )、0 89(10 .47% )、0 119(9.30 % )、0 14 1(8.14% )、0 9(8.14% ) 0 2 0 (6 .40 % )、0 137(5 .81% )和 0 10 1(5 .2 3% )等 8种为优势血清型。同一猪场存在多种血清型 ,大多数猪场有本场的优势血清型。同一地区的不同猪场流行的主要血清型一般不同。不同地区猪场的优势血清型有的相同 ,有的不同。四川规模化养殖场分离的E .coli血清型与 80年代初报道的血清型比较已发生了较大变化。

养殖场空气中E.coli磺胺类抗生素的抗性

本文从养殖场空气中分离出360株E.coli(大肠杆菌,Escherichia coli),应用肉汤微量稀释法和PCR方法,分离磺胺甲唑敏感菌株,检测抗生素抗性和抗性基因.在分离的E.coli中,对磺胺甲唑敏感菌株为95株(26.4%),有48株含有青霉素、氯霉素、四环素、环丙沙星、庆大霉素和利福平的抗性,而47株未含有抗性.其中,7株菌株含有1种抗生素抗性、11株菌株含有2种抗生素抗性、17株菌株含有3种抗生素抗性、6株菌株含有4种抗生素抗性、4株菌株含有5种抗生素抗性、3株菌株含有6种抗生素抗性.对抗生素的耐受能力依次为:氯霉素、青霉素、四环素、环丙沙星、庆大霉素、利福平.磺胺甲唑敏感菌株共检出163个抗性基因,sul1、int1、sul2、Int2、sul3检出数量依次为49、44、29、20和19;含一种、二种、三种、四种、五种抗性基因菌株分别为45、22、10、7、2;但有6株未检测出抗性基因.结果表明养殖场建场时间、抗生素使用、养殖规模等与抗生素抗性菌的抗性呈正相关;养殖场空气中分离的E.coli抗生素抗性较高,且具有多重抗性;抗生素抗性的表现型与其基因型之间出现不完全吻合现象.

固定化E.coliBL21(pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽

分别以卡拉胶、明胶、海藻酸钠包埋 E.coli BL 2 1 ( p Trc- gsh)细胞催化合成谷胱甘肽( GSH)。从酶活收率及机械强度方面进行比较 ,选择卡拉胶为包埋载体 ,其最适 p H为 7.0 ,最适温度为 40°C。相关物质对 GSH的合成均有影响 :半胱氨酸、甘氨酸的最适浓度为 2 0 mmol/ L,谷氨酸的最适浓度为 60 mmol/ L;Mg2 + / ATP为 1～ 5 ( V/ V)较合适 ;腺苷二磷酸 ( ADP)浓度为 5 mmol/ L时对酶活的抑制为 2 0 %。优化条件下罐式反应器中 GSH的产量为 0 .84g/ L,操作稳定性较好 ;延迟加入甘氨酸时 GSH产量可提高 1 7.5 % ;与酵母生产 ATP体系相耦联的共固定化体系在填充床中反应 ,GSH合成量达 1 .2 4 g/ L,收率比直接加入 ATP提高 2 4 .2 %

大肠杆菌E.coli HB101(pBR322)高密度培养过程质粒的稳定性

通过正交实验考察了大肠杆菌E.coli HB101-pBR322)高密度培养过程中，不同培养条件对质粒的稳定性和β(内酰胺酶活力的影响. 结果表明，当温度在33(39oC、pH为6.4-7.2、DO为 40%-80%、 补料速率在5.4-10.8 g/h范围内变化，以及细胞密度达到27.3 g/L、比生长速率达到0.73 h-1时，质粒没有发生丢失现象，但在培养过程中β-内酰胺酶的活力降低.

梅山猪E.coli F18菌株攻毒试验及其表型的鉴定分析

利用E.coli F18菌株攻毒试验来获得梅山猪断奶仔猪E.coli F18敏感和抗性型个体,可以为今后利用高通量技术研究仔猪抗E.coli F18遗传机理提供宝贵的素材,同时也为中国地方猪品种细菌性疾病模型的建立提供指导和参考。本研究以中国地方品种梅山猪断奶仔猪为研究对象,采用F18ab和F18ac菌株口服攻毒试验,并利用仔猪肠道E.coli F18细菌检测、细菌计数以及小肠上皮细胞黏附试验等进行验证。结果表明:攻毒后梅山仔猪出现腹泻、轻度腹泻和不腹泻3种不同的表型,腹泻仔猪肠道内容物中的细菌数量远多于不腹泻仔猪;同时黏附试验发现腹泻仔猪小肠上皮细胞大量黏附F18大肠杆菌,而不腹泻仔猪小肠上皮细胞与细菌基本不黏附;病理组织切片结果表明,重度腹泻仔猪病变肠道黏膜层绒毛高度均缩短,并且回肠组织间隙内有充血现象,空肠组织黏膜层绒毛脱落,由此可以推测大肠杆菌F18与仔猪小肠上皮细胞受体结合后,主要对小肠绒毛完整性造成了影响,从而定居繁殖造成仔猪腹泻。以上试验结果进一步表明,本试验中仔猪腹泻确实由E.coli F18菌株攻毒造成,并成功获得了E.coli F18抗性型和敏感型仔猪个体,为今后猪细菌性腹泻遗传基础研究素材和抗病育种基础群的获得提供了有效可行的方法和途径。

人PBM C中IL-18基因的克隆及在E.coli中的高效表达与纯化

从一名丙型肝炎病人的外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中分别克隆了前体和成熟人白细胞介素－１８（ｈＩＬ－１８）的基因，并应用大肠杆菌表达系统（ｐＱＥ－３０），成功地表达了重组ｈＩＬ－１８的前体和成熟蛋白。从人ＰＢＭＣ中提取总ＲＮＡ，用ｐｏｌｙ（Ｔ）８－１２反转录成ｃＤＮＡ，再以ＰＣＲ扩增出特异ＤＮＡ 片段。利用Ｅ．ｃｏｌｉ表达载体ｐＱＥ－３０，构建分别表达ｈＩＬ－１８前体和成熟蛋白的的重组质粒ｐＱＥＩＬ１８ｐ 和ｐＱＥＩＬ１８ｍ ，转化Ｅ．ｃｏｌｉＭ１５后，经ＩＰＴＧ诱导，表达出相对分子质量分别为２４ＫＤ和１９ＫＤ的重组蛋白，表达量占菌体蛋白的３０％ 和３５％ 。序列测定证实，ｈＩＬ－１８前体蛋白基因长５８２ｂｐ，成熟蛋白基因长４７７ｂｐ。经金属螯合层析纯化，获得了高纯度的表达蛋白。生物学活性鉴定，重组成熟蛋白能显著刺激Ｃｏｎ

hIL-16 cDNA的克隆、测序及在E.coli中的表达与纯化研究

在国内首次从人的外周血单个核细胞（PBMC）中克隆了人白细胞介素—16（hIL－16）cDNA，并应用一种新型的大肠杆菌表达系统一硫氧还蛋白表达系统，成功地表达了重组hIL-16。hIL-16cDNA的扩增：从人PBMC中提取总RNA，poly（T）8-12反转录cDNA，以半巢式PCR扩增出特异的DNA片段。hIL-16cDNA的克隆、测序与表达：利用E．coli表达载体pTrxFus，构建hIL－16。DNA的重组质粒，转化E．coli后，经色氨酸诱导，表达出相对分子质量（Mr）为30000的可溶性融合蛋白，表达量占菌体蛋白的30％。序列测定证实，此片段长393bp，确为hIL-16cDNA。经一步渗透压休克，即获得了高纯度的表达蛋白。

人粒细胞集落刺激因子基因重组及在E.coli中的表达和鉴定

将RT－PCR扩增的人粒细胞集落刺激因子（hG－CSF）结构基因与表达载体pJGW1重组，转化含有pGP1－2质粒的E.coliDH5α，进行温度诱导表达。经SDS－PAGE分析，rhG－CSF表达量占菌体总蛋白量的30％以上。将其复性，经CM－52FF离子交换层析纯化，纯化后的rhG－CSF（纯度＞98％）经SDS－PAGE测定分子量约为19kD；经胰酶裂解、反相HPLC分析肽谱具有8条特异肽段；等电聚焦测定PI值约为5．8；免疫印迹实验证实其与标准hG－CSF具有相同的抗原反应特异性；NH2-末端氨基酸分析与文献报道一致，采用小鼠白血病细胞株NFS－60测定活性为I×108IU／mg。

使用SPR生物传感器快速检测大肠杆菌E.Coli 0157∶H7

利用大肠杆菌抗体的免疫吸附反应,使用集成化手持式 SpreetaTM SPR传感器快速检测大肠杆菌E.Coli 0157∶H7,采用亲和素 生物素系统放大检测的响应信号,并引入复合抗体作为二次抗体,使该传感器对大肠杆菌的检测限由106cfu/mL下降到105cfu/mL。