Comparative Performance of Microscopy and Nested PCR for the Detection of Cryptosporidium Species in Patients Living with HIV/AIDS in Abidjan (Côte d’Ivoire)

Cryptosporidium spp. infection is one of the causes of diarrhea in people living with HIV/AIDS. The objective of this study is to compare the sensitivity of microscopy and molecular biology to determine the prevalence of Cryptosporidium spp. in Patients Living With HIV (PLWH). This is a descriptive cross-sectional study conducted in three care centers for people living with HIV/AIDS in Abidjan. It took place from November 2018 to March 2020. Sociodemographic data were obtained via a questionnaire. Stool and blood samples were collected and analyzed for microscopy and Nested PCR detection of Cryptosporidium spp. Blood samples were analyzed for CD4+ count. A total of 363 stool samples were collected from the three sites. Individuals aged 40 - 50 years (36.52%) were most likely to participate in the study. HIV Type 1 accounted for 86.22% of the study population. The samples collected consisted of 47.65% diarrheal stool. Microscopic examination of the stool yielded a prevalence of 3.86% for Cryptosporidium spp. while the prevalence was 3.96% with molecular identification. No statistically significant difference was observed between these two prevalences (χ2 = 0.26;p = 0.609). CD4+ count was the factor associated with Cryptosporidium spp. infection for both microscopy (OR = 0.887, p = 0.001) and PCR (OR = 0.896, p = 0.001). This study demonstrated that Nested PCR improves the detection of Cryptosporidium spp. in patient diagnosis.

宁夏地区奶牛源隐孢子虫分子鉴定与分析

为了明确宁夏地区奶牛隐孢子虫的流行情况及其优势基因型,采集宁夏4个地区10个规模化奶牛养殖场中1174份奶牛粪便样品,基于核糖体小亚基RNA(SSU rRNA)基因通过套式PCR进行检测和分析。结果显示,宁夏地区奶牛隐孢子虫阳性率为28.5%(335/1174);共鉴定出4种虫种,即微小隐孢子虫、牛隐孢子虫、瑞氏隐孢子虫和安氏隐孢子虫,阳性率分别为40.6%(136/335)、36.1%(121/335)、19.4%(65/335)和3.9%(13/335);微小隐孢子虫共鉴定出4种基因亚型,分别为ⅡdA15G1(n=70)、ⅡdA18G1(n=26)、ⅡdA19G1(n=23)和ⅡdA20G1(n=17)。统计学分析显示,在宁夏地区,0~2月龄的犊牛隐孢子虫感染率最高,且奶牛隐孢子虫的感染率与月龄差异显著相关(P<0.001)。表明宁夏地区奶牛存在隐孢子虫感染且存在人畜共患虫种,ⅡdA15G1微小隐孢子虫是宁夏地区奶牛感染的优势亚型。

福建省部分规模化畜禽场隐孢子虫感染情况调查

为了解福建省规模化畜禽场隐孢子虫感染情况,对10个规模化畜禽场(牛场、猪场、羊场、鸡场、鸭场各2个)100份粪样采用隐孢子虫通用引物进行荧光定量PCR检测,结果相应牛场、猪场、羊场、鸡场、鸭场的隐孢子虫平均检出率分别为60.0%、45.0%、42.1%、42.9%和15.0%。该结果可为福建省规模化畜禽场的隐孢子虫防控及保障公共卫生安全提供参考。

微小隐孢子虫转录共激活因子CpADA2的生物信息学分析及其编码基因的真核表达

本研究旨在对微小隐孢子虫转录共激活因子ADA2的结构和功能进行生物信息学分析,对其编码基因CpADA2进行真核表达。利用在线生物信息学软件对CpADA2进行生物信息学分析,结果显示,CpADA2含有ZnF和SANT结构域,全长673个氨基酸残基,分子质量为76 kDa,属于可溶性蛋白;不含跨膜区和信号肽,但存在多样化的激酶特异性磷酸化位点;二级结构由α螺旋(36.70%)、β折叠(11.74%)和无规卷曲(51.56%)构成;三级结构中SANT结构域呈典型的α螺旋串联重复构象;互作网络模型和功能预测表明,该蛋白具有锌离子结合特性,并可能参与组蛋白乙酰化过程。以微小隐孢子虫cDNA为模板,PCR扩增得到CpADA2基因,成功构建了真核表达质粒p3×FLAG-CMV14-CpADA2,转染至293T细胞后,Western blot分析显示,转染重组质粒的细胞成功表达重组CpADA2蛋白。本研究为后续开展CpADA2的功能研究提供了基础。

双膦酸盐抗三种顶复门原虫研究进展

顶复门原虫可引起严重疾病威胁人类健康,如每年导致近100万人死亡的疟原虫,感染全球约1/3人口的弓形虫以及导致新生儿腹泻的隐孢子虫等。这3种顶复门原虫对全球的生物安全和公共卫生构成巨大隐患,且目前在临床上有效治疗药物有限。双膦酸盐临床上广泛用于治疗骨代谢疾病,但其化合物可有效抑制顶复门原虫生长,作用机制为竞争性抑制寄生虫类异戊二烯分子生物合成的2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(MEP途径)中的法尼基焦磷酸合酶,干扰类异戊二烯化合物的合成而发挥作用。本文综述了双膦酸盐化合物在疟原虫、弓形虫和隐孢子虫方面的相关研究,以期为临床治疗相关疾病提供理论基础。

北京地区猫4种肠道原虫流行病学调查

隐孢子虫和贾第鞭毛虫等原虫不仅可寄生于猫的肠道,同时可引起人类感染。为掌握北京地区猫肠道常见原虫的感染情况,本调查于2021年6—12月共采集628份北京市不同区域猫的粪便样本并提取核酸,对胎儿三毛滴虫ITS1-5.8S rRNA-ITS2基因、蓝氏贾第鞭毛虫核糖体RNA小亚基(SSU rRNA)基因、隐孢子虫SSU rRNA基因和囊等孢球虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mtCOI)基因进行PCR扩增和测序,并统计分析这4种肠道原虫的感染率和感染风险因素;针对蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫阳性样本,根据蓝氏贾第鞭毛虫的β-贾第素(bg)、谷氨酸脱氢酶(gdh)和磷酸丙糖异构酶(tpi)基因以及隐孢子虫的60 kDa糖蛋白(gp60)基因对其进行分子分型。结果显示,北京地区猫肠道原虫的总感染率为20.22%(127/628),混合感染率为16.54%(21/127);其中,胎儿三毛滴虫感染率为10.19%(64/628)、蓝氏贾第鞭毛虫感染率为6.69%(42/628)、隐孢子虫感染率为4.46%(28/628)、囊等孢球虫感染率为3.03%(19/628)。蓝氏贾第鞭毛虫基因型为集聚体B(26/41)、F(12/41)、C(1/41)、AⅠ(1/41)和A/F(1/41),隐孢子虫均为猫隐孢子虫,包括XIXa(23/25)和XIXc(2/25)亚型家族。经分析,纯种猫更易感染胎儿三毛滴虫和蓝氏贾第鞭毛虫(P<0.05),患猫的主要临床症状是腹泻或软便(P<0.01);年龄小于1岁、雌性和未绝育的猫更易感染隐孢子虫(P<0.05或P<0.01);年龄小于1岁、未绝育、未免疫和未驱虫的猫更易感染囊等孢球虫(P<0.01)。结果表明,北京地区猫感染的原虫存在人兽共患基因型,包括蓝氏贾第鞭毛虫集聚体A和B以及猫隐孢子虫亚型家族XIXa和XIXc,有潜在的人兽共患风险。

喀什地区某规模化引种场奶牛感染隐孢子虫的PCR检测与种系发育分析

[目的]掌握新疆维吾尔自治区喀什地区某规模化引种场奶牛的隐孢子虫(Cryptosporidium)感染情况及其种类分布特征。[方法]采集该场不同年龄段奶牛粪便样本190份,基于小亚基核糖体RNA基因(SSU rDNA),采用PCR方法检测隐孢子虫感染情况,经序列比对鉴定隐孢子虫种类。利用卡方(χ^(2))检验法,比较不同年龄段奶牛隐孢子虫感染率的差异。采用PCR方法扩增微小隐孢子虫(C.parvum)、牛隐孢子虫(C.bovis)和芮氏隐孢子虫(C.ryanae)的gp60基因,经序列比对鉴定3种隐孢子虫的基因亚型,构建种系发育树解析其遗传进化特征。[结果]32份奶牛粪便样本呈隐孢子虫阳性,总体感染率为16.84%(32/190);鉴定出4种隐孢子虫,分别为微小隐孢子虫(n=8)、安氏隐孢子虫(C.andersoni,n=10)、牛隐孢子虫(n=10)和芮氏隐孢子虫(n=4)。以3月龄以下断奶前犊牛的隐孢子虫感染率较高,为28.00%(14/50),不同年龄段奶牛隐孢子虫的感染率差异显著(χ^(2)=8.679,P<0.05)。8份微小隐孢子虫阳性样本成功获得7条gp60基因亚型序列,鉴定出2种亚型,分别为ⅡdA15G1亚型(n=3)和ⅡdA19G1亚型(n=4);10份牛隐孢子虫阳性样本成功获得6条gp60基因亚型序列,鉴定出3种亚型,分别为ⅩⅩⅥb(n=2)、ⅩⅩⅥc(n=3)和ⅩⅩⅥe(n=1);4份芮氏隐孢子虫阳性样本均成功获得gp60基因亚型序列,均为ⅩⅩⅠb亚型。种系发育树分析结果显示,获得的微小隐孢子虫Ⅱd基因亚型序列与不同宿主源微小隐孢子虫Ⅱd亚型家族的序列同处于一个亚群,而与新西兰不同宿主源微小隐孢子虫Ⅱa家族亚型的序列形成不同亚群;获得的牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫的亚型序列均与我国不同地区牛源牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫的亚型序列同处一个大群。[结论]该引种场奶牛感染的隐孢子虫存在遗传多样分布特征,均为引进当地后感染,提示水源和草料污染可能是该场奶牛感染隐孢子虫的主要原因。

微小隐孢子虫含有纤维连接蛋白Ⅲ型结构域蛋白的亚细胞定位及其细胞黏附特性研究

目的本研究以微小隐孢子虫含有纤维连接蛋白Ⅲ型结构域蛋白(Cryptosporidium parvum fibronectin typeⅢdomain-containing protein,CpFN3)为研究对象,研究其亚细胞定位和黏附特性。方法该蛋白由cgd4_640基因编码、全长为含有2430个氨基酸的I型跨膜蛋白。设计特异性抗原多肽并免疫家兔,获得多克隆抗体,利用亲和纯化法获特异性抗体;经Western blot方法验证该抗体特异性,再通过间接免疫荧光法(IFA)进行蛋白定位。通过原核表达获得重组蛋白(His-CpFN3),通过ELISA确定重组蛋白与HCT-8细胞和肝素的结合情况。结果成功获得纯化的抗CpFN3抗体,Western blot分析显示该抗体可识别条带大小约为280 kDa;IFA结果表明该蛋白定位于子孢子的表膜,呈点状分布。该蛋白在子孢子入侵阶段及胞内无性繁殖和有性繁殖阶段均有表达。利用重组蛋白,确定了CpFN3能够与HCT-8细胞及肝素结合(结合常数Kd分别为0.23和1.21μmol/L),并呈剂量依赖性和可饱和性。结论本研究确定CpFN3参与了虫体与宿主细胞的黏附过程。

柯坪县规模化养殖场双峰驼隐孢子虫感染情况调查与种类鉴定

[目的]掌握新疆维吾尔自治区阿克苏地区柯坪县规模化养殖场双峰驼隐孢子虫的感染情况和种类分布情况。[方法]从柯坪县4个乡(镇)6个规模化双峰驼养殖场共收集516份粪便样本,全部提取DNA样本,基于隐孢子虫(Cryptosporidium)SSU rDNA序列进行PCR检测,序列比对分析后进行隐孢子虫种类鉴定;采用χ^(2)检验法比较不同规模化养殖场双峰驼隐孢子虫的感染率差异;将被鉴定为微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum,C.parvum)阳性的DNA样本,基于gp60基因序列进行PCR检测,序列比对分析后进行微小隐孢子虫亚型鉴定。[结果]516份双峰驼粪便DNA样本中检测出34份隐孢子虫阳性,总体感染率为6.59%(34/516),以阿恰勒镇养殖场2的双峰驼隐孢子虫感染率最高,为9.57%(9/94);不同养殖场双峰驼隐孢子虫的感染率统计学差异显著(χ^(2)=5.497,P<0.05)。基于SSU rDNA序列,34条隐孢子虫序列经比对分析,鉴定出3种隐孢子虫,分别为安氏隐孢子虫(n=29)、隐孢子虫大鼠基因型Ⅳ(n=1)和微小隐孢子虫(n=4);基于gp60基因序列,4条微小隐孢子虫序列经比对分析,均鉴定为Ⅰd-like-A21亚型,具有独特的遗传进化特点。[结论]柯坪县双峰驼隐孢子虫感染率较低,其感染的微小隐孢子虫具有独特亚型。研究结果为我国双峰驼源隐孢子虫种类分布特征和遗传进化提供了基础数据。

微小隐孢子虫氨基酸转运蛋白CpAAT1的亚细胞定位研究

目的探究微小隐孢子虫氨基酸转运蛋白的亚细胞定位。方法本研究以微小隐孢子虫氨基酸转运蛋白1(Cryptosporidium parvum Amino acid transporter 1,CpAAT1)为研究对象,设计合成了特异性多肽片段,免疫家兔制备多克隆抗体。利用Western blot验证该抗体的特异性,通过间接免疫荧光的方法对该蛋白的亚细胞定位进行了分析。结果CpAAT1多克隆抗体能特异性识别虫体天然蛋白,后者在微小隐孢子虫生活史的各个时期均有表达。子孢子时期,CpAAT1定位于虫体表膜;无性生殖期时该蛋白定位在成熟的裂殖子表膜;在有性生殖阶段,雌雄配子体均可被该抗体标记。结论本研究为进一步探索微小隐孢子虫氨基酸转运蛋白的转运机制提供了一些新线索。

隐孢子虫(Cryptosporidium)病毒的鉴定及其特性

根据已发表的隐孢子虫病毒的序列 ,设计合成 2对引物 ,对小球隐孢子虫 ( Cryptosporidium parvum)、鼠隐孢子虫 ( C.muris)、贝氏隐孢子虫 ( C.baileyi)、火鸡隐孢子虫 ( C.meleagridis)进行 RT-PCR扩增 ,结果发现仅小球隐孢子虫 ( C.parvum)含有大小约为 1 .7× 1 0 3nt和 1 .3× 1 0 3nt2个片段的 ds RNA病毒。将其PCR产物连接到 p MD1 8-T载体上进行克隆测序 ,经与 Gen Bank比较 ,含这 2个片段的 ds RNA病毒与已发表的该虫病毒的同源性分别为 96%和 98%。电泳鉴定发现 ,该病毒对低浓度 RNA酶不敏感 ,且不能被 DNA酶降解。依赖 RNA的 RNA聚合酶活性测定结果表明 ,该病毒具有该聚合酶的活性。电镜观察未发现存在病毒样粒子。

灌南县域肉羊源人兽共患隐孢子虫的流行病学调查及其类型分析

以隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)18S rRNA为靶基因,通过巢氏PCR检测发现在采集的101份新鲜粪便样品中18份样本为阳性。不同地区羊场的隐孢子虫感染率分别为:李集镇36%(18/50),新安镇0%(0/30)、堆沟港镇0%(0/21)未检出隐孢子虫。但通过对4羊场的分析发现,有2个羊场(50%)为隐孢子虫感染阳性,且不同的羊场感染率差异显著,因此单纯的以地区来评价隐孢子虫的感染率,是值得商榷的。山羊隐孢子虫的感染率为33.3%,湖羊隐孢子虫的感染率为2%。2~6月龄的育肥羊隐孢子虫的感染率为36%,6~10月龄的育成羊(0%)。对检测为阳性的样品进行了隐孢子虫18S rRNA基因片段序列分析,发现18个样品全部为肖氏隐孢子虫(Cryptosporidium xiaoi),不存在泛在隐孢子虫(Cryptosporidium ubiquitum)。在检测隐孢子虫感染阳性的1个山羊场和1个羊湖羊场均存在肖氏隐孢子虫感染,不存在泛在隐孢子虫,更未发现肖氏隐孢子虫和泛在隐孢子虫的混合感染。目前的数据提示肖氏隐孢子虫对2~6月龄山羊(33.3%)和湖羊(2%)具有更高的感染率。这18份样品来源于2个规模羊场,属于李集镇两个羊场。

水环境中隐孢子虫检测分析方法与分布特征

基于隐孢子虫卵囊结构、虫种/基因型和介水传播路径,围绕水环境样本中隐孢子虫的分离纯化、浓度检测、虫种识别、活性判定和感染性评价,综述了相关技术方法,并对其优缺点、适用性进行了归纳总结.基于文献中全国60个地区2667份水环境样品的隐孢子虫分析数据,系统梳理了我国不同地区、不同环境水体中隐孢子虫检出率、浓度等赋存分布特征.结果表明:隐孢子虫在不同地区和不同水体类型中的赋存特征存在显著差异,总体检出率高达32.8%,表明这一公共卫生隐患不容忽视.

宿主上皮细胞非编码RNA调控隐孢子虫感染的分子机制研究进展

隐孢子虫是全球分布的重要人兽共患病原,其感染可导致人和动物严重腹泻甚至死亡,严重威胁人体健康及畜牧业发展。目前对隐孢子虫入侵机制、致病机理以及宿主防御隐孢子虫感染的调控机制知之甚少,是阻碍开发治疗性药物和疫苗的重要瓶颈之一。据研究报道,宿主上皮细胞非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)参与调控对抗隐孢子虫感染的诸多生物学过程,如调控细胞因子释放、TLR/NF-κB等信号通路、炎性反应等。论文综述了宿主上皮细胞微小RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA)在防御隐孢子虫感染过程中的作用机制。

禽类隐孢子虫与其他病原感染相关性研究进展

隐孢子虫作为一种重要的胞内寄生原虫,感染谱广泛,主要侵犯呼吸道、胃肠道和法氏囊,禽类感染后主要表现为精神萎靡、腹泻、免疫低下和呼吸困难等临床症状。多重病原协同感染是近些年禽病的主要流行形式,禽类隐孢子虫作为一种重要的机会性致病病原,其感染与宿主的免疫功能直接相关,当器官/组织伴有其他病原同时感染时,可使疾病风险和防控难度加剧。目前,禽类隐孢子虫流行病学数据相对较少,与其他病原感染相关性研究尚不明朗。本文通过对国内外研究数据的梳理、归纳,对禽类隐孢子虫流行及其与呼吸道、消化道和法氏囊感染的其他病原的相关性进行综述,为进一步研究其间的协同致病机制奠定基础。

小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)P15基因的克隆和表达

通过 PCR扩增出小球隐孢子虫 (Cryptosporidium parvum) P1 5基因片段。将该片段连接到克隆质粒载体 p U C1 9的 Bam H 酶切位点上 ,并对其序列进行了测定。结果表明 ,该基因长度为 4 79bp,编码的表面蛋白由 1 4 8个氨基酸残基组成。再将 P1 5蛋白基因片段分别在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达 ,经 SDS- PAGE分析和 Western blot检测 ,结果表明 ,小球隐孢子虫 P1 5蛋白基因在大肠杆菌内获得表达的融合蛋白相对分子质量为 5 0 0 0 0 ;在哺乳动物细胞中 ,重组痘病毒表达的蛋白相对分子质量为 1 80 0 0～ 2 2 0 0 0 ,与直接从自然感染牛小球隐孢子虫分离的 P1

河北省圈养貉子隐孢子虫流行现状调查

目的:确定河北省圈养貉子隐孢子虫的流行和虫种/基因亚型分布情况。方法:从河北省多地共采集389份新鲜圈养貉子粪便样品,采用基于隐孢子虫核糖体小亚基rRNA(SSU rRNA)基因的巢式PCR方法进行检测,并对获得的隐孢子虫SSU rRNA基因阳性样本进行隐孢子虫60 kDa糖蛋白(gp 60)基因的扩增,对获得的隐孢子虫SSU rRNA和gp 60基因进行测序和分析,并分别在Mega中构建基于这2个基因的进化树(最大似然法),进一步分析所获隐孢子虫的分子特性。结果:基于隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR检测显示,河北省圈养貉子中共检测出6份隐孢子虫阳性样本,隐孢子虫感染率为1.5%(6/389)。其中,6月龄以上貉子的隐孢子虫感染率为1.2%(1/85),6月龄以下貉子的隐孢子虫感染率为1.6%(5/304),二者无显著差异(χ^(2)=0.096,P=0.384)。粪便非正常的貉子隐孢子虫感染率(11.1%,4/36)显著高于粪便正常的貉子(0.6%,2/353)(χ^(2)=23.18,P=0.001)。序列及进化树分析显示,本次从河北省貉子中分离的隐孢子虫虫种均为C.canis,共鉴定出2种基因亚型,即XXa2和XXa4。结论:河北省圈养貉子中存在2种人兽共患的C.canis基因亚型XXa2和XXa4,提示貉子可能成为人隐孢子虫感染的潜在来源。

隐孢子虫病的流行现状

隐孢子虫病是由隐孢子虫(Cryptosporidium)寄生于人类、家养动物及多种野生动物胃肠道引起的一种严重的人畜共患胃肠疾病。该病不但威胁人类健康,亦严重影响畜牧业发展。近年来随着研究的深入,隐孢子虫的流行表现出许多新的特点,危害远远超出了人们的估计。这些特点主要表现在:感染家畜,增加人类感染风险;与动物其他病原混合感染危害加重;感染野生动物,具有自然疫源性;感染海洋和水生动物,造成水体污染;经水源和食物传播引起人类群体感染;暴发感染对人群危害严重。深入开展隐孢子虫病流行病及防控研究对提高公共卫生水平具有重要意义。

隐孢子虫与宿主的相互作用机制研究进展

隐孢子虫是一种严重威胁人和动物健康的寄生性原虫,主要寄生于胃肠道上皮细胞,感染后引起人和动物的水样腹泻甚至死亡,可严重危害公共健康并带来较大的经济损失。由于目前尚无有效治疗和预防隐孢子虫病的措施,明确宿主和隐孢子虫的互作机制显得尤为重要。论文就隐孢子虫的研究概况、宿主对抗隐孢子虫感染的机制以及隐孢子虫逃避宿主防御反应的策略进行了综述,以期为开发防治隐孢子虫病的疫苗和药物提供参考。

我国猪群隐孢子虫感染情况及人兽共患风险分析

隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种重要的人兽共患寄生原虫,是引起隐孢子虫病(cryptosporidiosis)的病原。隐孢子虫可以通过水和食物感染包括人和家畜、家禽在内的多种宿主,引起宿主出现腹泻等症状,严重时可导致死亡,这不仅给畜禽养殖业造成巨大的经济损失,而且对公共卫生安全造成严重威胁。目前尚未见针对隐孢子虫病的有效疫苗或特效药物,因此,隐孢子虫病的流行病学调查显得尤为重要。对我国猪群隐孢子虫感染率、感染虫种分布、感染风险因素方面的研究进展进行综述,并对其人兽共患风险进行分析,以期为我国猪隐孢子虫病的综合防控提供参考。