建立一种EGFR突变检测的凸环引物荧光PCR新方法

目的建立一种能快速、有效检测EGFR突变的凸环引物荧光PCR新方法。方法同时用凸环引物荧光PCR技术法和Sanger测序法对混有不同比例的EGFR突变型质粒的样本进行对照检测,以对比两者灵敏度;采用两种方法对93例肺癌组织的EGFR基因进行热突变位点E746-A750del和L858R的检测,并统计其符合率。结果在93例肺癌组织的DNA中,凸环引物荧光PCR技术法和Sanger测序法检测到EGFR突变分别为29例(E746-A750del 15例,L858R14例)和28例(E746-A750del 15例,L858R 13例),符合率达96.6%,且凸环引物荧光PCR技术法能检测出混有5%突变质粒型的样本,其灵敏度达5%,比Sanger测序法高。结论凸环引物荧光PCR技术法比测序法更为简便,且灵敏度更高,易于实现,2小时内即可得出准确结果。

建立一种N-ras突变检测的“凸背”引物荧光PCR新技术

目的建立一种简便、省时、有效的N-ras突变检测的＂凸背＂引物荧光PCR新技术。方法对比＂凸背＂引物荧光PCR新技术和Sanger测序法：通过对混有不同比例的N-ras基因热突变G13D（GGT〉GAT）质粒的样本进行对照检测来比较两者的灵敏度;对97例急性髓细胞白血病（AML）患者的外周血的DNA进行N-ras的G13D突变检测,统计两者的符合率。结果 ＂凸背＂引物荧光PCR新技术能检测出混有5%突变质粒型的样本,其灵敏度达5%,高于Sanger测序法的10%~20%。在97例AML患者的外周血的DNA中,＂凸背＂引物荧光PCR新方法和Sanger测序法检测到N-ras基因G13D突变分别为19例和18例,符合率达94.7%。结论 ＂凸背＂引物荧光PCR新技术比测序法更为快速、简单,有更高的灵敏度,容易实现。

基于实时荧光定量PCR技术的当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量测定方法的开发及比较

目的:对当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的变化情况进行定量分析。方法:建立了实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR),对不同产地、不同收集企业、不同储藏时间当归饮片中金黄色葡萄球菌进行定量分析。荧光定量反应体系为SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10μL,正向引物、反向引物(10μmol·L-1)各0.8μL,模板/基因组DNA 1μL,双蒸水7.4μL。荧光定量反应条件为①扩增曲线:94℃预变性30 s,94℃变性10 s,60℃退火12 s,72℃延伸30 s,循环45次,72℃单点检测信号;②熔解曲线:72℃开始检测,以0.5℃为台阶温度停留15 s采集荧光。根据Real-time PCR的测定结果,分别从生当归、酒当归和土炒当归中选择具有代表性的样品进行平板计数法测定,并与Real-time PCR检测结果进行比较。结果:不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量排序为生当归>土炒当归>酒当归;在不同产地的当归饮片中均以甘肃渭源地区样品所含的金黄色葡萄球菌含量为最低;与零售企业相比,生产销售企业的生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量较低;不同储藏时间对生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量有一定的影响,随储藏时间的增加,金黄色葡萄球菌的含量增加。对部分代表性样品进行检测时发现,平板计数法检测结果数量级较Real-time PCR低3~4个数量级。结论:建立的Real-time PCR的特异性、灵敏度、准确性以及报告周期均优于平板计数法,可为当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的快速、准确定量检测提供有效技术手段。