MSPD-HPLC法分析云南红豆杉中的10-DAB Ⅲ和紫杉醇

为建立云南红豆杉(Taxus yunnanensis)中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)和紫杉醇(Taxol)的分析方法,该研究采用基质固相萃取-高效液相色谱分析(MSPD-HPLC)对云南红豆杉中的10-DABⅢ及Taxol进行定量分析,探究硅胶、佛罗里硅土、酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝、C_(18)、C_(18)-ME、C_(18)-G1、C_(18)-HC、Diol、Xamide、Xion共12种样品预处理分散剂及各种分散剂的质量、洗脱剂的种类、洗脱剂的浓度、洗脱剂体积对两种成分分析的影响,并对优化后的条件进行方法学验证,同时与超声提取、热回流提取预处理方法进行比较分析证明其有效性。结果表明:(1)12种固相分散剂中,碱性氧化铝具有良好的目标化合物萃取物检出量,并且当碱性氧化铝与样品的质量比为3∶1、6 mL甲醇为洗脱剂洗脱时,10-DABⅢ和Taxol的萃取检出量较高。(2)建立的云南红豆杉枝叶中10-DABⅢ和Taxol的分析方法具有良好的线性关系(r≥0.9999),10-DABⅢ和Taxol的检出限和定量限分别介于0.0239~0.0301μg·mL^(-1)和0.142~0.178μg·mL^(-1)之间;各目标分析物平均加样回收率在93.6%~109.0%之间。(3)比较分析显示,3种方法对2种紫杉烷类化合物的萃取检出量基本无差别,但MSPD法溶剂消耗少、操作简单,分析时间短,净化效率高,可应用于云南红豆杉原料的快速分析。该研究以碱性氧化铝为分散剂应用于云南红豆杉紫杉烷类化合物的萃取,建立了快速、高效的云南红豆杉中10-DABⅢ和紫杉醇的分析方法,为云南红豆杉中的紫杉烷类化合物的定量分析提供了依据。

南方红豆杉枝叶中10-DABⅢ与紫杉醇HPLC检测及检测样的制备

采用单因素、多因素正交试验研究南方红豆杉枝叶中10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)、紫衫醇的高效液相色谱(HPLC)检测方法及检测样制备。结果显示,检测样制备采用10倍量甲醇于40℃恒温水浴条件下浸提3 h,即可使10-DABⅢ、紫杉醇得率达到峰值,且提取时间不宜超过3 h,否则会导致检出结果比实际含量偏低。由于采用10-DABⅢ、紫杉醇混合同时检测,结果发现选择适当的流动相梯度洗脱方案较为关键,较好的洗脱方案会使检测图谱的基线分离较好。

7β,10β-二甲氧基-10-DABⅢ的合成路线综述

卡巴他赛由FDA审核批准上市,临床上用于治疗激素难治性转移性前列腺癌。从结构上看,卡巴他赛是多西他赛7、10-OH甲醚化的衍生物,所以对7、10-OH进行选择性的甲醚化是卡巴他赛合成的关键技术点。7β,10β-二甲氧基-10-DABⅢ是卡巴他赛合成的关键中间体,本文对此中间体的合成路线进行综述,以期清晰地展示其合成研究现状,为卡巴他赛的合成研究及工业生产提供参考和借鉴。

反相高效液相色谱法测定曼地亚红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量的研究

目的:建立测定曼地亚红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)的反相高效液相色潜法。方法:采用硅胶层析柱(BUCHI,Φ12mm×75 mm,40～63μm),以甲醇-水(1:1)为洗脱剂对曼地亚红豆杉提取液进行初步分离制备供试品溶液;HPLC 检测条件:SHIM—PACK VP—ODS 色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),甲醇-水(45:55)为流动相,流速为1.0 mL·min^(-1),柱温为40℃,检测波长为232 nm。结果:10-DABⅢ浓度在0.04～4.00μg·mL^(-1)范围(r=0.9974),与峰面积呈良好线性关系(n=6);回收率(n=9)为99.5%～104.9%,RSD 为1.0%～1.8%。结论:曼地亚红豆杉提取液用硅胶柱层析后,多数高含量非目标物被分离,消除了高含量非目标物对10—DABⅢ测定的影响,HPLC 检测条件简单,获得满意的效果。

宁泌泰胶囊联合盐酸坦洛新缓释胶囊治疗ⅢB型前列腺炎的临床疗效及对患者前列腺液IL-10、TNF-α、PGE-2的影响

目的 探究宁泌泰胶囊联合盐酸坦洛新缓释胶囊治疗ⅢB型前列腺炎的临床疗效及对患者前列腺液白介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、前列腺素E2（PGE-2）的影响。方法 选择2015年12月～2016年10月于丽水市中心医院接受治疗的ⅢB型前列腺炎患者104例,根据治疗方法分为观察组和对照组,每组各52例。观察组使用宁泌泰胶囊联合盐酸坦洛新缓释胶囊治疗,对照组采用盐酸坦洛新缓释胶囊治疗。比较2组临床疗效,治疗前后慢性前列腺炎症状积分指数,最大尿流率、平均尿流率;分析治疗前后列腺液中水平IL-10、TNF-α、PGE-2与白细胞计数变化。结果 经治疗,观察组总有效率为90.4%,明显高于对照组72.0%（P〈0.05）;治疗后,观察组前列腺液中IL-10、TNF-α、PGE-2、WBC水平均明显低于对照组（P〈0.05）;观察组慢性前列腺炎症状积分指数明显低于对照组,最大尿流率、平均尿流率明显高于对照组,差异均具有统计学意义（P〈0.05）。结论 采用宁泌泰胶囊联合盐酸坦洛新缓释胶囊治疗ⅢB型前列腺炎患者临床疗效显著,能够通过下调列腺液中IL-10、TNF-α、PGE-2水平,缓解临床症状。

南方红豆杉枝叶中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的分离与纯化

目的:以南方红豆杉的枝叶为原料,研究其中活性成分10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)的分离和纯化条件,并进行优化筛选。方法:综合运用浸提、萃取(包括液液萃取和反萃取)、色谱分离和重结晶技术得到10- DABⅢ晶体,并采用UV,HPLC法进行分析鉴定。结果:得到了用以合成高效抗癌药紫杉醇的前体——10-DABⅢ晶体,纯度可达91%,整个工艺收率达7．9%。结论:本实验为首次采用该工艺路线得到10-DABⅢ和紫杉醇,总收率达60%以上,可用于进一步的工业化研究。

南方红豆杉10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶基因的克隆与生物信息学分析

对中国重要药用植物南方红豆杉中的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因进行分离、测序以及生物信息学分析。根据GenBank中已登录的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从南方红豆杉叶片中克隆了1个DBAT基因Tc-DBAT的全长cDNA。结果显示,Tc-DBAT cDNA含有1个1 323 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码440个氨基酸,对应基因组序列含有1个内含子。Tc-DBAT蛋白N端含有5个N-酰基化作用位点和2个保守的N-糖基化作用位点,具有1个保守的B ig-1结构域,多个重要的磷酸化位点以及1个类似钙结合蛋白重复结构。序列同源性比较、系统发生分析以及蛋白质高级结构预测均表明,Tc-DBAT属于转移酶超家族(transferase superfamily),是一个具有乙酰转移酶活性的功能蛋白,能够催化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)10位的乙酰化,从而生成抗癌新药紫杉醇生物合成途径中的最后一个双萜中间体——巴卡亭Ⅲ。有望通过成功克隆和鉴定紫杉醇生物合成途径中的关键酶基因达到提高其半合成前体巴卡亭Ⅲ产量的目的,并且为进一步利用组合表达系统商业化生产紫杉醇奠定基础。

云南红豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量的固相萃取-高效液相色谱法测定

目的建立以固相萃取-高效液相色谱（HPLC）法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。方法固相萃取柱：Agilent ODS C18500 mg/3 ml;色谱柱：Agilent zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm,5μm）,流动相：甲醇-水-乙腈（35∶55∶10）,流速1.0 ml.min^-1,检测波长227 nm,柱温30℃。结果 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ在1.6-8.0μg.ml^-1范围内,进样量与色谱峰面积呈良好的线性关系,r=0.999 9,平均回收率为96.8%,RSD为4.8%（n=6）。结论该方法可用于云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量测定,方法稳定,结果准确、可靠。

南方红豆杉菌根菌液体纯发酵培养产紫杉醇及10-去乙酰巴卡亭Ⅲ

从南方红豆杉菌根菌中筛选出产紫杉醇和紫杉烷类化合物10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)的高产菌株,对分离获得的21株菌株进行了液体发酵培养实验,通过TLC、HPLC及LC-MS检测发现,有10株菌株具有产紫杉醇及紫杉烷类化合物的能力,其中4株菌株中产10-DAB分别为260.05、92.88、393.27、70.52μg/L,但未检出产紫杉醇;6株中产紫杉醇分别为434.94、1 242.19、200.65、360.77、317.90、29.82μg/L,但未检出产10-DAB,说明南方红豆杉的各种菌根真菌虽具有合成紫杉醇或紫杉烷类化合物的能力,但各自所合成化合物有差异,不同种类的菌根菌可能分别参与了紫杉醇生物合成的不同环节,即南方红豆杉菌根高含量紫杉醇的生物合成可能是多种菌根菌协同参与作用的结果,且其中的高产菌株具有发酵生产紫杉醇的潜力。

苯并-10-氮杂-15-冠-5取代的单Schiff碱的合成及其锰(Ⅲ)配合物的催化环氧化性能

由苯并 10 氮杂 15 冠 5经Mannich反应、还原和缩合制得了含单氮杂冠醚的水杨醛亚胺单Schiff碱HL1和HL2.研究了它们的锰(Ⅲ)配合物MnL21Cl和MnL22Cl的仿酶催化性能,并与非冠醚类似物MnL23Cl比较,考察了配体芳环上挂接氮杂冠醚环对锰(Ⅲ)配合物的催化环氧化性能的影响.结果表明,在常温常压下,MnL21Cl和MnL22Cl比MnL23Cl具有更高的催化活性.其中,具有正庚氧基的MnL22Cl最佳,苯乙烯转化率52.6%,环氧化选择性96.2%,摩尔转化频率(TOF)17.5h-1.

生物反馈电刺激对ⅢB型前列腺炎EPS中IL-10、PGE_2水平的影响及临床意义

目的:分析ⅢB型前列腺炎患者生物反馈电刺激治疗前、后前列腺液(EPS)中白细胞介素-10(IL-10)、前列腺素E2(PGE2)水平的变化以及与慢性前列腺炎症状的关系,探讨生物反馈电刺激治疗ⅢB型前列腺炎的作用机制。方法:50例ⅢB型前列腺炎患者作为观察组,非前列腺炎患者、尿常规及EPS常规检查正常者23例作为对照组,观察组采用生物反馈治疗仪治疗12周,检测治疗前、后国际前列腺炎症状评分(CPSI)、IL-10、PGE2水平,并与对照组进行比较。结果:治疗前观察组CPSI和EPS中PGE2水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05～0.01),EPS中IL-10水平差异无统计学意义(P>0.05)。观察组治疗后3个月和治疗结束后1个月CPSI和EPS中PGE2水平明显低于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05),EPS中IL-10水平与治疗前相比变化不大(P>0.05),3个指标与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。观察组EPS中的IL-10、PGE2与CPSI呈正相关(r值分别为0.563 5、0.432 9,P<0.01)。结论:ⅢB型前列腺炎患者EPS中IL-10和PGE2水平升高,其慢性盆痛症状严重程度与EPS中IL-10、PGE2水平呈正比。生物反馈电刺激治疗可能通过降低PGE2水平以改善ⅢB型前列腺炎患者的临床症状。

不同扶正方对红豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ煎出量的影响

目的：建立红豆杉水煎液中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10．DABⅢ）HPLC分析方法，观察不同扶正方（养阴代表方、益气代表方、温阳代表方）对红豆杉中10．DABⅢ煎出量的影响。方法：采用反相高效液相色谱法，c18色谱柱（4．61mm×250mm，5μgm），流动相为甲醇：水（40：60），流速为1mL／min，检测波长为：227Bin，柱温为25℃。结果：10-DABⅢ在20～400μg／mL范围内峰面积与含量成线性关系（Y=6．5015X4-20．792，r=0．99997），平均回收率为103．86％（RSD=1．83％）。红豆杉组、红豆杉配伍养阴代表方组、红豆杉配伍益气代表方组、红豆杉配伍温阳代表方组中10-DABⅢ的含量依次为（2．004±0．091）、（2．286±0．0734）、（2．096±0．097）、（1．640±0．138）mg（n=3）。结论：不同扶正方对红豆杉中10．DABⅢ煎出量存在明显差异，可为红豆杉临床合理使用提供参考实验依据。

云南红豆杉生长过程中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量变化

目的研究云南红豆杉生长过程中不同部位10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-deacetyl baccatinⅢ）的含量变化。方法采用色谱柱Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）,流动相为甲醇-乙腈-水（42∶13∶45）,流速1.0 m l.min^-1,柱温32℃,检测波长234 nm,测定云南红豆杉生长过程中不同部位10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。结果回归方程Y=15.290 29X-4.059 76（r=0.999 0）,线性范围5.50～550μg.ml^-1;加样回收率（n=6）98.6%,RSD为2.4%。在云南红豆杉生长期树皮中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量高于枝叶,是枝叶中最高含量的1.498倍;休眠芽分化期和休眠期是10-去乙酰巴卡亭Ⅲ积累的关键时期,在枝叶中的含量显著高于树皮,最高含量达0.115 0%是树皮中最高含量的1.769倍,二年生枝叶中含量略高于一年生枝叶。结论该方法简便、准确度高,可用于云南红豆杉枝叶的质量控制。

高效液相色谱法测定云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的含量

目的:建立云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭III含量的测定方法。方法:样品经干燥研细后采用甲醇浸提、乙酸乙酯萃取,测定同一批细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭III含量,采用Spherisorb C185μm柱,流动相甲醇-乙腈-水(42∶13∶45),流速1.0ml/min,检测波长为234nm。结果:云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量为0.023 47%,平均回收率为100.6%,变异系数(RSD)为2.2%。结论:该方法能准确、快速测定云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量,为探讨10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ在细胞培养物中的代谢研究提供测定方法。

HPLC法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量

目的 本实验采用RP-HPLC法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-deaxetylbaccatin Ⅲ）的含量。方法 利用C18色谱柱（250mm×4．6mm，5μm）甲醇-乙腈-水（5：35：60）作为流动相，检测波长为227nm。结果 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ在0．096～1．947μg与峰面积线性关系良好，Y=1351．973X＋1．903（R^2=0．999），平均回收率为95．90％，RSD为1．94％。结论 此方法可靠简便、重现性好、灵敏度高，具有很高的实用价值，而且未见报导，可用于红豆杉植物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的定性、定量分析。

南方红豆杉与引种德国曼地亚红豆杉茎、叶中紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量的比较

目的：建立HPLC法同时测定并比较南方红豆杉与德国引种曼地亚红豆杉茎、叶中紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量。方法采用CosmasilTMC18色谱柱（250mm×4．6mm，5μm）；以乙腈-水（50∶50）为流动相；流速为1．0mL·min-1；检测波长为227nm；柱温：30℃。结果紫杉醇、10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的线性范围分别为2．675～42．8μg·mL-1（r＝0．9993）和3．875～62μg·mL-1（r＝0．9996），平均加样回收率（n＝9）分别为98．1％和101．6％，RSD分别为2．7％和2．3％。南方红豆杉与德国引种曼地亚红豆杉的茎、叶中紫杉醇含量分别为0．12和0．10mg·g^-1，10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量分别为0．12和0．14mg·g^-1。结论引种红豆杉与南方红豆杉在同一地区的生态环境下生长，茎、叶中所含紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量有显著性差异（P＜0．05）。所建立方法准确，简便，适用于红豆杉的质量评价，为不同栽培品种的选择提供参考。

白细胞介素-10对实验性肝纤维化大鼠肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

目的:探讨外源性IL10对实验性肝纤维化大鼠肝星状细胞ColⅠ和ColⅢmRNA表达的影响。方法:60只清洁级SD雄性大鼠,随机分为生理盐水对照组(N组,8只)、CCl4组(C组,28只)和IL10干预组(I组,24只)3组,于造模第7周和第11周分别随机选取一批大鼠,分离肝星状细胞并提取总RNA,以半定量RTPCR方法检测各组ColⅠ和ColⅢmRNA表达的水平。结果:随着肝纤维化的进展,C组ColⅠ和ColⅢmRNA的表达增加并呈增强趋势(与N组比较,P<0.01;与第7周比较,ColⅠP<0.01;ColⅢP<0.05)。造模第7周,Ⅰ组ColⅢmRNA的表达量低于C组(P<0.01);造模第11周,两种胶原Ⅰ组的表达量均进一步下降(与C组比较,P<0.01;与第7周比较,ColⅠP<0.05;ColⅢP<0.01),与正常组差异无显著性意义(P>0.05)。结论:随着肝纤维化进展,肝星状细胞内ColⅠ和ColⅢmRNA的表达增加,外源性IL10能显著降低两者的表达。

小剂量糖皮质激素治疗ⅢA型前列腺炎中前列腺液TNF-α及IL-10的表达变化及意义

目的:分析小剂量糖皮质激素治疗ⅢA型前列腺炎的效果及对前列腺液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白介素-10(IL-10)的表达变化影响。方法:选取2018年1月-2019年11月医院收治的100例ⅢA型前列腺炎患者作为研究对象,按照随机数字表法分为对照组和试验组,对照组50例予以常规治疗,在此基础上试验组予以小剂量糖皮质激素治疗。治疗4周后,比较两组患者临床疗效、美国国立卫生研究院慢性前列腺炎症状指数(National Institutes of Health chronic prostatitis symptom index,NIH-CPSI)评分及治疗前后前列腺液TNF-α、IL-10水平,并分析前列腺液TNF-α及IL-10水平与NIH-CPSI的相关性。结果:治疗4周后,试验组总有效率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗4周后,试验组疼痛与不适症状、排尿症状、生活质量及NIH-CPSI总分均明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗4周后,试验组前列腺液TNF-α及IL-10水平均明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关系数法分析结果显示,前列腺液TNF-α及IL-10与NIH-CPSI评分均呈显著正相关性(r>0,P<0.05)。结论:在常规治疗基础上给予小剂量糖皮质激素治疗ⅢA型前列腺炎,可进一步提高疗效,减轻炎症反应程度,明显改善NIH-CPSI评分,且未加重不良反应,值得临床重视。

从云南红豆杉细胞培养物中分离鉴定10-去乙酰巴卡亭Ⅲ

目的:从云南红豆杉(Taxus yunnanensis)细胞培养物中提取、分离和纯化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-deacetyl baccatinⅢ,10-DABⅢ)。方法:采用固液分离、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、重结晶等方法从细胞培养物中提取分离得到10-DABⅢ,并用波谱解析(1HNMR,13CNMR)对其结构进行了鉴定。结果:建立了从红豆杉细胞培养物中提取、分离和纯化10-DABⅢ的方法,证明与从天然红豆杉植物中得到的10-DABⅢ为同一化合物。结论:本方法简便、成本低,可用于红豆杉细胞培养物中10-DABⅢ的提取、分离。

肝硬化患者血清IL-6、IL-10和HA、PⅢP检测的临床意义

目的探讨了肝硬化患者血清IL-6、IL-10和HA、PⅢP水平的变化及临床意义。方法分别应用放免法和ELISA法对61例肝硬化患者进行了血清IL-6、IL-10和HA、PⅢP含量检测并与30名正常人作比较。结果肝硬化患者血清IL-6、IL-10和HA、PⅢP含量均非常显著地高于正常人组(P<0.01),相关分析显示,肝硬化患者血清HA、PⅢP水平与IL-6、IL-10呈明显正相关(r=0.6216、0.5127、0.4875、0.4715,P<0.01)。结论细胞因子IL-6、IL-10在肝纤维化形成中发挥重要作用,在早期肝纤维化的诊断中具有一定的临床实用价值。