响应面法优化南方红豆杉中10-DAB提取工艺及其含量测定

为探究南方红豆杉(Taxus wallichiana var.mairei)中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)的最佳提取工艺,本研究以南方红豆杉中10-DAB含量为指标,以料液比、提取时间及超声温度为考察因素,采用单因素试验结合响应面法优化10-DAB的提取工艺,并采用超高效液相色谱(UPLC)法检测不同采摘部位、不同生长年限及不同采收时节的10-DAB含量差异。结果表明,南方红豆杉中10-DAB的最佳提取工艺条件为料液比1∶15(g/mL)、提取时间23 min、超声温度40℃,该工艺条件下10-DAB的含量为1.18%,与理论值相对偏差为0.42%。UPLC检测结果表明,南方红豆杉叶的10-DAB含量显著高于枝和树皮,且10-DAB全年累积含量受季节影响明显,10月份达到最高值。该研究可为南方红豆杉中10-DAB的提取利用提供参考依据。

不同地理种源南方红豆杉中紫杉醇和10-DAB含量及影响因子

选择福建省梁野山、龙栖山、闽侯旗山、南靖书洋乡和南平大坪村南方红豆杉(Taxus chinensis var.marei)天然群体分布相对集中区,采集胸径相同的南方红豆杉的当年生针叶和树皮并取树下土壤样品。利用超高效液相色谱分析测定南方红豆杉当年生针叶及树皮中紫杉醇及10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-deacetylbaccatin Ⅲ,10-DAB)含量,另测定土壤pH值、速效磷、速效氮、铁、钙、镁、锌含量。结果表明,不论是紫杉醇还是10-DAB含量,不同地理种源南方红豆杉间差异均较大,说明地理位置对于红豆杉中紫杉醇和10-DAB含量具有明显的影响;树皮中紫杉醇含量与土壤中铁含量显著相关(P<0.01);南方红豆杉当年生针叶中及树皮中紫杉醇含量与各种源地气象因子的相关性不显著(P>0.05)。

叶面施肥对南方红豆杉针叶中紫杉醇和10-DAB含量的影响

人工栽培红豆杉已成为目前解决紫杉醇市场需求的主要途径,如何提高人工栽培的红豆杉中紫杉醇及其化学半合成前体10-脱酰基巴卡丁Ⅲ(10-DAB)的含量是一个十分关键的问题。对人工栽培南方红豆杉叶面喷施不同浓度的N、K、Ca、Mg肥和自行配置的稀土混合肥(含La、Ce、Sm),连续4次跟踪采样,超高效液相色谱(UPLC)测定样品中紫杉醇和10-DAB的含量。结果表明,叶面喷施不同浓度的N元素均引起红豆杉针叶中紫杉醇和10-DAB含量的降低;喷施K元素,前期引起10-DAB含量的增加但随之降低,紫杉醇的含量则持续降低;喷施不同浓度的Ca、Mg提高了红豆杉中紫杉醇和10-DAB的含量,其作用可持续一段时间;自行配置的稀土混合肥明显地提高了紫杉醇和10-DAB的含量且其持续作用时间较长,紫杉醇和10-DAB的含量分别最高可达0.261mgg-1和0.641mgg-1。

胸径、构件和季节对南方红豆杉中紫杉醇和10-DAB含量的影响

系统采集了12个不同胸径的南方红豆杉当年生针叶和树皮样品,用超高效液相色谱(UPLC)测定其紫杉醇(taxol)和10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-deacetylbaccatin Ⅲ,10-DAB)含量,结果显示针叶的两种被测试物质含量的平均值分别为0.0127mg·g-1和0.0805mg·g-1,树皮的这两种物质含量平均值分别为0.1164mg·g-1和0.4842mg·g-1。当年生针叶、树皮中紫杉醇含量与胸径相关性不显著。对植株不同构件(枝条、针叶、树皮和根)中紫杉醇和10-DAB含量的测定表明,根中紫杉醇和10-DAB含量最高,当年生针叶紫杉醇含量最低。天然和人工栽培南方红豆杉当年生针叶中紫杉醇和10-DAB含量呈明显的季节变化,各月份间含量差异显著,人工栽培和天然植株针叶在生长速度明显减缓的10月份,紫杉醇和10-DAB含量均出现一个明显的峰值。

遮荫对云曼红豆杉活性成分10-DAB及矿质营养累积的影响

光照是植物生长的必要环境因子,揭示不同遮荫处理对云曼红豆杉苗木活性成分10-DAB、矿质营养累积和光合作用的影响,为云曼红豆杉林下综合利用和林-草复合生态系统的构建提供科学依据。以2年生云曼红豆杉实生苗为材料,设置5种光强条件,阐明云曼红豆杉对不同光照环境的响应策略。结果表明,遮荫对云曼红豆杉苗木各生长时期10-DAB累积具有显著影响(P<0.05),10-DAB产量在4-10月呈上升趋势,10月达到最大值;随着遮荫的增强,各部位矿质元素的累积量均呈先增加再降低的趋势,其中,N和P在75%遮荫处理下最高,含量大小依次为叶>根>茎,K在50%遮荫处理下最高,含量大小依次为叶>茎>根;遮荫可以显著提高云曼红豆杉光合色素含量(P<0.05),随遮荫的增强呈“先升后降”的变化规律,75%遮荫下最大,净光合速率(P_(n))、气孔导度(G_(s))和蒸腾速率(T_(r))的变化规律同光合色素相一致,胞间CO_(2)浓度(C_(i))则是先降低后增加,在95%遮荫下的各指标(除C_(i))均最低。重度遮荫抑制了云曼红豆杉光合作用,遮荫强度可以有效提高云曼红豆杉苗木(枝叶)10-DAB产量及矿质营养累积,云曼红豆杉苗木培育宜选50%-75%遮荫。

南方红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)的测定

目的:测定南方红豆杉枝叶中10-脱乙酰巴卡亭III(10-deacety lbaccatinⅢ,10-DABⅢ)的含量。方法:采用RP-HPLC法。C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)乙腈-水系统(乙腈:水=30:70)为流动相,检测波长232nm,流速1.0ml/min。结果:10-DABⅢ在进样0.3～6μg之间有良好的线性关系(R=0.9999),平均回收率=97.3%,RSD=2.14%(n=6)。结论:该法简单、精确、快速、重复性好,可以满足其原料和制剂的质量控制要求。

超临界CO_2流体萃取云南红豆杉枝叶中10-DAB的工艺研究

目的:研究超临界CO2流体萃取云南红豆杉枝叶中10-DAB的工艺。方法:原料经超临界CO2萃取后,通过工业色谱纯化。以10-DAB的收率为指标,采用单因素试验分别考察不同夹带剂量、萃取时间、萃取压力及温度、分离釜Ⅰ的压力及温度对10-DAB收率的影响,再用正交试验进行条件优化。结果:在夹带剂量(80%乙醇)与药材比3∶1、萃取釜压力25 MPa及温度60℃、萃取时间90 min、分离釜Ⅰ压力14 MPa及温度40℃等较佳的条件下进行超临界CO2萃取;萃取物经工业色谱分离纯化后即得10-DAB。结论:超临界CO2萃取及分离纯化10-DAB的工艺简单可行。

指数施肥对云曼红豆杉幼苗活性成分10-DAB及养分累积的影响

以1年生云曼红豆杉实生容器苗为材料,设置不施肥对照(CK)以及不同施肥量的平均施肥(AF1、AF2)、指数施肥(EF1、EF2、EF3和EF4)等7个处理,测定不同施肥方式和施肥量下苗木各时期活性成分10-DAB含量、生长量、枝叶生物量和10-DAB累积量,以及各部位N、P和K养分累积情况,探究施肥方式及施肥量对云曼红豆杉幼苗活性成分10-DAB及养分累积的影响,为云曼红豆杉苗期养分精准调控与高效培育提供理论和实践依据。结果表明:(1)施肥显著提高了幼苗枝叶中10-DAB含量,促进了生长及枝叶生物量累积(P<0.05);在相同施氮量下,指数施肥处理枝叶生物量显著大于平均施肥(P<0.05),枝叶中10-DAB含量以EF2、EF3处理较高,生长和枝叶生物量以EF2处理最大。(2)EF2处理的枝叶10-DAB累积量显著大于其他处理(P<0.05),并表现为:EF2>EF1>AF2>EF3>AF1>EF4>CK,EF2处理分别较AF1和AF2处理提高30.61%~41.94%和18.14%~25.00%。(3)施肥对幼苗各部位N、P和K含量的影响显著(P<0.05);在相同施氮量下,指数施肥各部位的N、P和K含量均优于平均施肥;指数施肥处理中,根系中的N含量以及各器官K含量随施肥量增加而上升,各部位P含量以及茎和叶中N含量随施肥量增加先上升后下降;各处理N、P和K分配比例呈现出叶>根>茎规律。幼苗各器官中N与P、P与K以及根、叶中的N与K之间均表现出显著(P<0.05)正相关,呈现出协同关系。(4)云曼红豆杉幼苗的10-DAB累积量在9~10月份最高,此时采收可获得的10-DAB累积量最高,收益也最大。研究发现,指数施肥与平均施肥相比有效提高了云曼红豆杉苗木活性成分10-DAB及养分累积,并以施肥量为1600 mg·株^(-1)的苗木各指标表现较优。

利用响应面法优化巴卡亭III生成10-DAB的工艺条件

10-脱乙酰基巴卡亭III(10-DAB)是紫杉烷类抗肿瘤药物多烯紫杉醇的前体物质。采用响应面法优化成团泛菌P2-A-8转化巴卡亭III生成10-DAB的工艺条件。利用Box-Behnken试验和方差分析,从菌体培养时间、菌体浓度OD600、底物终浓度、转化温度、转化时间5个方面优化成团泛菌P2-A-8转化巴卡亭III生成10-DAB的工艺条件。结果表明,获得最佳转化工艺条件为:菌体经过二级培养12 h,转接后调节初始OD600为3.0,此时,加入溶解于甲醇的巴卡亭III溶液,使其终浓度为0.007 mg/m L,32℃,200 r/min下转化4 d,此时10-DAB的生成率达到24.5%,比优化前提高了446.8%。实验结果表明,响应面法优化成团泛菌P2-A-8转化巴卡亭III生成10-DAB的工艺条件合理可行。该研究成果对于多烯紫杉醇生物合成具有重要的应用价值。

7β,10β-二甲氧基-10-DABⅢ的合成路线综述

卡巴他赛由FDA审核批准上市,临床上用于治疗激素难治性转移性前列腺癌。从结构上看,卡巴他赛是多西他赛7、10-OH甲醚化的衍生物,所以对7、10-OH进行选择性的甲醚化是卡巴他赛合成的关键技术点。7β,10β-二甲氧基-10-DABⅢ是卡巴他赛合成的关键中间体,本文对此中间体的合成路线进行综述,以期清晰地展示其合成研究现状,为卡巴他赛的合成研究及工业生产提供参考和借鉴。

超临界CO_(2)萃取南方红豆杉中挥发油和10-DABⅢ的工艺优化

目的 优化超临界CO_(2)萃取法萃取南方红豆杉中挥发油和10-DABⅢ的工艺条件。方法 以萃取时间、萃取温度、萃取压力、分离温度、物料与夹带剂的比例和夹带剂浸泡时间等为考察因素,以红豆杉中挥发油的得率和10-DABⅢ的含量为评价指标,采用正交试验优选最佳工艺条件。结果 最佳工艺条件为以无水乙醇为夹带剂,物料与夹带剂比例为1:3,萃取压力270 bar、萃取温度35℃、分离温度40℃,萃取时间2.5 h。红豆杉挥发油的得率为23.422%,10-DABⅢ的含量0.546‰。结论 所用工艺稳定、可行,可用于红豆杉中挥发油和10-DABⅢ的提取。

耦合培养法对10-DAB产量的影响

[目的]比较红豆杉内生真菌单独发酵和耦合发酵对10-DAB产量的影响,以获得10-DAB产量较高的发酵方法。[方法]比较了红豆杉枝条、产10-DAB菌株Trichoderma sp.单独发酵、红豆杉愈伤组织、红豆杉枝条和产10-DAB菌株Trichoderma sp.耦合发酵、红豆杉愈伤组织和产10-DAB菌株Trichoderma sp.耦合发酵5种方法 10-DAB的产量,用HPLC-MS方法验证产有10-DAB并检测其浓度。[结果]5种方法获得10-DAB浓度分别为274.6μg/m L、154.3μg/m L、189.4μg/m L、887.5μg/m L、684.7μg/m L,其中红豆杉枝条和产10-DAB菌株Trichoderma sp.耦合发酵浓度最高达887.5μg/m L,为耦合发酵法生产10-DAB奠定基础。[结论]利用红豆杉枝条与产10-DAB菌株耦合发酵生产10-DAB的产量要比菌株单独发酵的产量高出2.2倍。

云南红豆杉活性成分10-DAB累积分布规律

为研究云南红豆杉10-DAB的累积规律及单株10-DAB累积量,采用HPLC法测定不同海拔、不同生长时期、不同采收期的云南红豆杉枝叶中10-DAB含量,同时测定枝叶生物量.结果显示:红豆杉中10-DAB累积受季节影响显著,从4月份到10月份呈现逐渐递增趋势,10月份10-DAB累积达到最高,之后呈下降趋势;生长年限为2年时,其10-DAB累积最高,且与3、4、5年相比具有显著差异(P<0.05),之后随生长年限增加10-DAB累积逐年下降;10-DAB累积在海拔(900±50)m以下无显著性差异(P>0.05),高于(900±50)m后随海拔增加而降低,且与(500±50)m相比有极显著性差异(P<0.01);生长年限相较于海拔,权重占比更大,对10-DAB的累积影响更大;从单株10-DAB累积量来看,海拔高于900 m,单株枝叶10-DAB累积量随海拔升高而呈下降趋势;3年生单株枝叶10-DAB累积量大于2、4和5年生,单株10-DAB累积量最高可达0.697±0.026 g.本研究表明,生长年限、季节、海拔、生物量均显著影响云南红豆杉单株10-DAB累积量,适宜种植云南红豆杉10-DAB药用原料林的最佳海拔范围应在500-900 m,最佳采收生长年限为第3-4年,采收季节10月份;结果可为云南红豆杉最佳生长条件的选择及科学采收提供理论依据.

紫杉烷二萜类化合物10-DABⅢ的分离纯化

目的:建立分离纯化紫杉烷二萜类化合物10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)的方法。方法:采用柱层析和重结晶的方法精制10-DABⅢ。以杂质含量为指标确定层析液比例;以纯度和收率为指标筛选第1次重结晶时三氯甲烷的用量,第2次重结晶时丙酮、正己烷的用量以及2次重结晶的温度和时间。结果:层析液丙酮与三氯甲烷体积比为2.25:7.75,此时杂质含量最小,为3.7%。用15倍体积(W/V)的三氯甲烷、-25℃冷冻24h第1次重结晶以及35倍体积的丙酮(W/V)和30倍体积的正己烷(W/V)、-25℃冷冻12h第2次重结晶,纯化后的样品纯度为99.34%,收率为83.50%。结论:该方法对10-DABⅢ分离纯化效果好。

10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ羟基保护反应过程的研究

对半合成紫杉醇类化合物的关键步骤 １０－去乙酰基巴卡亭 Ⅲ（１０－ＤＡＢ）的羟基保护反应进行了研究。结果表明，利用氯甲酸（２，２，２－三氯）乙酯作为羟基保护基，获得７。１０－二（三氯乙氧基）－１０一去乙酰基巴卡亭Ⅲ［７，１０－ｄｉ（Ｔｒｏｃ）－１０－ＤＡＢ］的反应为连串反应，受反应时间和温度影响较大。当反应温度为 ８０℃，反应时间为 ２ ｍｉｎ时，目的产物 ７，１０－ｄｉ（Ｔｒｏｃ）－１０－ＤＡＢ的反应选择性最好。

反相高效液相色谱法测定曼地亚红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量的研究

目的:建立测定曼地亚红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)的反相高效液相色潜法。方法:采用硅胶层析柱(BUCHI,Φ12mm×75 mm,40～63μm),以甲醇-水(1:1)为洗脱剂对曼地亚红豆杉提取液进行初步分离制备供试品溶液;HPLC 检测条件:SHIM—PACK VP—ODS 色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),甲醇-水(45:55)为流动相,流速为1.0 mL·min^(-1),柱温为40℃,检测波长为232 nm。结果:10-DABⅢ浓度在0.04～4.00μg·mL^(-1)范围(r=0.9974),与峰面积呈良好线性关系(n=6);回收率(n=9)为99.5%～104.9%,RSD 为1.0%～1.8%。结论:曼地亚红豆杉提取液用硅胶柱层析后,多数高含量非目标物被分离,消除了高含量非目标物对10—DABⅢ测定的影响,HPLC 检测条件简单,获得满意的效果。

南方红豆杉枝叶中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的分离与纯化

目的:以南方红豆杉的枝叶为原料,研究其中活性成分10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)的分离和纯化条件,并进行优化筛选。方法:综合运用浸提、萃取(包括液液萃取和反萃取)、色谱分离和重结晶技术得到10- DABⅢ晶体,并采用UV,HPLC法进行分析鉴定。结果:得到了用以合成高效抗癌药紫杉醇的前体——10-DABⅢ晶体,纯度可达91%,整个工艺收率达7．9%。结论:本实验为首次采用该工艺路线得到10-DABⅢ和紫杉醇,总收率达60%以上,可用于进一步的工业化研究。

南方红豆杉菌根菌液体纯发酵培养产紫杉醇及10-去乙酰巴卡亭Ⅲ

从南方红豆杉菌根菌中筛选出产紫杉醇和紫杉烷类化合物10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)的高产菌株,对分离获得的21株菌株进行了液体发酵培养实验,通过TLC、HPLC及LC-MS检测发现,有10株菌株具有产紫杉醇及紫杉烷类化合物的能力,其中4株菌株中产10-DAB分别为260.05、92.88、393.27、70.52μg/L,但未检出产紫杉醇;6株中产紫杉醇分别为434.94、1 242.19、200.65、360.77、317.90、29.82μg/L,但未检出产10-DAB,说明南方红豆杉的各种菌根真菌虽具有合成紫杉醇或紫杉烷类化合物的能力,但各自所合成化合物有差异,不同种类的菌根菌可能分别参与了紫杉醇生物合成的不同环节,即南方红豆杉菌根高含量紫杉醇的生物合成可能是多种菌根菌协同参与作用的结果,且其中的高产菌株具有发酵生产紫杉醇的潜力。

采用分步柱层析法生产紫杉醇前体物10—去乙酰基浆果杉亭Ⅲ

采用０．２％￣０．９％的柠檬酸溶液渗漉红豆杉枝叶，渗漉液利用分步柱层析法从中提取抗癌新药紫杉醇的前体物１０－去乙酰基浆果杉亭Ⅲ，提取率可达９０％以上。

四种不同品种红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的含量测定

目的:测定国内主要4种不同品种红豆杉枝叶中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABIII)的含量。方法:采用RP-HPLC法。色谱柱为C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-水(25∶75),检测波长为232 nm,柱温为32℃,流速为1.0 m L/min。结果:10-DABⅢ在进样0.1~5μg之间呈良好线性关系(r=0.999 8),平均回收率=99.10%,RSD=1.51%。结论:该法操作简便快速,准确度高,重复性好,可作为国内引种的不同品种红豆杉中10-DABⅢ的含量测定方法。