低剂量辐射诱导小鼠生精细胞凋亡及p53基因表达的适应性反应

目的研究低剂量X射线照射诱导小鼠睾丸生精细胞凋亡及p53基因表达的适应性反应。方法通过不连续泛影葡胺密度梯度离心法分离睾丸组织不同种类生精细胞,采用碘化丙啶荧光探针标记细胞,流式细胞术检测各类生精细胞凋亡,免疫组化法观察生精细胞p53蛋白表达。结果当1.0、2.0或3.0Gy(攻击剂量,D2)照射前6h给予75mGy(诱导剂量,D1)预照射时明显减轻D2对精原细胞和精母细胞的凋亡损伤作用,而对精子细胞和精子影响不明显。当D2照射前6h给予D1预照射时明显减少精原细胞和精母细胞p53基因表达阳性率,而对精子细胞和精子影响不明显。结论低剂量X射线照射可选择性诱导小鼠睾丸精原细胞和精母细胞凋亡的适应性反应,并与D1和D2间隔时间及D2剂量有关。同时,可诱导精原细胞和精母细胞p53基因表达的适应性反应,推测其在低剂量辐射诱导生精细胞凋亡适应性反应分子机制中起重要的调控作用。

腺病毒介导p53基因对胰腺癌细胞抑制作用的体外实验研究

目的探讨腺病毒介导p53基因（adenovims—mediated p53 gene，Ad-p53）对人胰腺癌细胞株PANC-1的生长抑制作用。方法以Western Blot方法检测加入Ad—p53后PANC-1细胞在48h、72hp53表达情况以及未处理组细胞48h、72hp53的表达。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色实验检测不同MOI值的Ad—p53感染后，PANC-1细胞的生长情况并绘制生长曲线，用PI、annexin V—FITC双重染色并用流式细胞技术检测受感染细胞的凋亡比例。结果Westem Blot结果显示，处理组细胞内48h、72hp53蛋白表达明显高于相同时间点对照组细胞；MTT结果显示不同MOI值细胞生长抑制情况不同，MOI值越高，对细胞生长的抑制程度也越高；流式检测细胞在MOI值为150时，0h、48h、72h凋亡比例分别为（7．5±0．8）％、（22．5±2．3）％和（34．4±2．7）％，对照组细胞为（5．8±0．4）％、（8．3±1．7）％和（9．7±2．1）％。结论Ad-p53能有效感染胰腺癌细胞，导致胰腺癌细胞凋亡。

基因-病毒治疗系统CNHK500-p53的构建和体外初步研究

目的构建一种新的基因-病毒治疗系统。方法通过基因操作技术将目的基因表达盒mCMV启动子+p53基因+SV40polyA插入腺病毒E1A基因受端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控、E1B基因受缺氧反应元件(HRE)启动子调控的增殖病毒载体质粒pSG500的E1A下游,得到腺病毒质粒pSG500-p53;通过pSG500-p53与5型腺病毒右臂的质粒pBHGE3在293细胞中同源重组得到重组病毒CNHK500-p53;利用Westernblot和ELISA法检测病毒E1A、E1B基因和p53抑癌基因的表达;TCID50方法测定病毒滴度;通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力;应用细胞病理效应(CPE)实验检测病毒抗肿瘤作用。结果CNHK500-p53的病毒滴度为2×1010pfu/ml,增殖实验证实CNHK500-p53可以选择性地在端粒酶阳性和缺氧微环境的肝癌细胞中增殖,CNHK500-p53所携带的p53基因在肝癌细胞株中的表达量388±34.6μg/L明显高于非增殖型腺病毒载体Ad-p53的76.3±13.17μg/L(P<0.005),并显示了较强的抗肿瘤效应。结论CNHK500-p53是一种具备治疗肝癌潜力的新型基因-病毒治疗系统。

从贮存20年的微量细胞中提取DNA并做PCR分析的实验研究

目的:探讨从二十年前贮存的食管拉网微量细胞涂片中提取DNA并进行食管癌基因检测的方法和可行性,比较P53基因的突变在食管癌前期病变和正常食管上皮中的差异。方法:利用螯合型的离子交换树脂Chelex100作为介质,一步法从食管拉网脱落细胞提取DNA,应用PCR-SSCP方法和PCR-RFLP方法进行p53基因第5外显子及第7外显子的突变检测。结果:48例标本P53基因检测均获成功。食管上皮重度不典型增生细胞中发现有5例突变发生,均为p53基因第7外显子,而第5外显子未发现突变;正常食管鳞状上皮拉网脱落细胞中均未发现突变。检测到的5例突变中,其中有3例分别在10年、12年和14年后转变为食管癌。结论:Chelex100法能从微量细胞涂片中提取DNA,使对20年前食管拉网细胞涂片标本进行分子水平的检测成为可能。为食管癌前期病变的研究提供一种新的方法。p53基因的突变使食管上皮癌前期病变细胞具有了癌变趋势。