基于“微生物-肠-脑轴”探讨补肾通腑方对APP/PS1小鼠肠道菌群及LPS/TLR4/NF-κB通路的影响

目的探讨补肾通腑方调控肠道菌群,改善阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)模型小鼠学习记忆能力的作用机制。方法以APP/PS1小鼠为研究对象,给予补肾通腑方治疗8周,采用Morris水迷宫法观察小鼠空间学习记忆能力变化;16S rDNA检测小鼠肠道菌群丰度、多样性变化;HE染色观察海马病理形态学变化;免疫荧光检测海马区小胶质细胞活化情况;Western blot检测TLR4、NF-κB、IL-6等炎症因子表达。结果与模型组相比,补肾通腑方可以缩短AD模型小鼠逃避潜伏期、游泳路径,增加跨越平台次数(P<0.05),提升肠道菌群多样性,调节肠道菌群丰度,促进海马神经元细胞损伤修复,降低iNOS/Iba1共表达,提高Arg1/Iba1共表达(P<0.01),促进小胶质细胞从M1型向M2型转化,下调TLR4、NF-κB、IL-6等促炎因子的表达。结论补肾通腑方改善AD模型小鼠学习记忆能力的作用机制可能与调节肠道菌群介导的LPS/TLR4/NF-κB通路,从而抑制促炎型小胶质细胞活化、减轻中枢神经系统炎症、改善海马区神经元细胞损伤有关。

利用16S-23S rDNA RFLP及16S rRNA基因序列分析方法对湖北省饭豆(Vigna umbellata L.)根瘤菌系统发育的研究

采用16S-23S rDNA间隔区段(IGS)PCR-RFLP与16S rRNA基因部分序列分析的方法对饭豆根瘤菌进行了遗传多样性及系统发育分析.由16S-23S rDNA IGS PCR-RFLP分析可知,所有菌株在52%的相似性水平上聚在一起,形成了慢生型菌群与快生型菌群这两大菌群.群Ⅰ中,在79%相似性的水平上分为ⅠA与ⅠB两个分支.群Ⅱ中,在62%相似性的水平上分为ⅡA与ⅡB两个分支,分支ⅡA在72%的相似性水平上进一步分为ⅡA1、ⅡA2和ⅡA3三簇;分支ⅡB中的饭豆根瘤菌与标准菌株USDA205T聚在一起,表现的差异并不大.由16SrRNA基因部分序列分析结果可知,供试的4个代表菌株分别位于不同的系统发育分支中.CYR4243与Sinorhizobium fredii的模式菌株USDA205T的序列相似性达到了99.87%.HCY1101与Rhizobium leguminosarum中的三叶草生物型(bv.trifolii)和豌豆生物型(bv.viceae)这两个生物型的参比菌株亲缘关系最近,序列相似性为100%.HCY5202与R.galegae亲缘关系最近,序列相似性为99.86%.CYY3302与Bradyrhizobium elkanii的参比菌株USDA86有最近的亲缘关系,序列相似性近似于100%.

ε-多聚赖氨酸产生菌的筛选及16SrDNA测序鉴定

利用ε-多聚赖氨酸(ε-PL)与亚甲基蓝在静电排斥的作用下能够形成透明圈的性质,初步筛选出10株产ε-PL的菌。然后摇瓶发酵复筛,根据发酵上清液与DR(dragendorff)试剂反应和纸层析两者均成阳性反应,以及参照Itzhaki方法计算发酵产物中ε-PL产量,从而筛选出编号为4#、8#、Y#的三株产量较高的菌株,其ε-PL产量分别达到0.757、0.751、0.808g/L。再采用基于16S rDNA序列分析和系统发育分析的方法,对4#、8#、Y#三株菌进行分子生物学鉴定,最终确定4#可能是Delftia acidovorans,8#可能是Stenotrophomonas maltophilias,Y#可能是Streptomyces griseolus。

天祝白牦牛α_(S1)-酪蛋白基因和κ-酪蛋白基因的PCR-RFLP研究

利用PCR—RFLP技术熏检测了天祝白牦牛αS1-酪蛋白(αS1-casein,αS1-CN)基因和κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN)基因部分序列的遗传多态性熏结果表明:天祝白牦牛群体αS1-CN基因表现单态,κ-CN基因存在遗传多态性。κ-CN基因PCR-RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0.0745和0.9255。κ-CN基因PCR-RFLP位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定理(P>0.05)。天祝白牦牛群体内平均基因一致度、基因多样度和有效等位基因数分别为0.9311、0.0689和1.0739。

应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳和16S rDNA技术分析果冻胀气原因

目的分析某品牌果冻胀气的原因。方法提取胀气果冻总DNA,采用聚合酶链式反应-变性度凝胶电泳技术(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)进行菌群结构分析,同时采用平板分离法从果冻中分离细菌。并将分离得到的菌株进行16S rDNA扩增和测序比对分析。将分离的菌株接种到正常果冻中进行产气实验。结果 PCR-DGGE和平板分离结果表明,在胀气果冻中分别只检测到一种细菌,未检测出真菌。测序比对结果表明该细菌属于芽孢乳杆菌属。将该菌接种到正常果冻中会引起果冻胀气。结论芽孢乳杆菌是导致该品牌果冻胀气的主要因素。

16S-23S rDNA内转录间隔区序列寡核苷酸探针鉴定分支杆菌菌种的研究

目的 研究以16S-23S rDNA 内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列为靶基因设计分支杆菌菌种寡核苷酸探针,应用PCR-反向杂交技术快速鉴定分支杆菌菌种。方法 应用PCR-反向杂交技术检测26种36株分支杆菌标准株,24株分支杆菌临床分离株。结果 分支杆菌标准株和临床分离株经PCR扩增,依菌种不同可见一条约340bp-450bp范围DNA片段。探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除草分支杆菌探针。MPH与微黄分支杆菌亦杂交外,其余探针均为特异的。5株结核分支杆菌临床分离株鉴定为结核分支杆菌复合群,19株非结核分支杆菌临床分离株鉴定至种水平。结论 16S-23S rDNA ITS PCR-反向杂交鉴定分支杆菌菌种简便、快速、准确,具有较高应用价值。

MALDI-TOF MS与16S rDNA方法对乳酸菌鉴定分析比较

本研究通过将基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)法与16S rDNA序列分析法,对于乳酸菌鉴定的准确性以及微生物系统分类学相关分析结果进行比较,采用MALDI-TOF MS对本实验所保藏的3株乳酸菌标准菌株,及由乳制品中分离得到的12株乳酸菌进行蛋白质谱图收集,比对谱图特征峰对其进行鉴定及系统进行学分析;同时,进行16S rDNA提取并测序,得到分子生物化学水平鉴定,采用邻近连接法对16S rDNA序列进行系统进化树分析。结果表明,经MALDI-TOF MS与16S rDNA测序对试验所用的15株乳酸菌鉴定,乳杆菌属的2株微生物种水平鉴定结果存在偏差,其他13株鉴定结果一致;两种方法所得到的数据均可得出聚类热图及系统发育树,虽可确定为同一科水平,但不同属种水平微生物亲缘距离与位置有一定差异。MALDI-TOF MS法鉴定乳酸菌有着快速、准确的优势,但仍需要通过优化算法并扩大数据库以准确建立系统发育相关性。

PCR-RFLP法分析白酒小曲细菌多样性

采用CTAB法提取白酒小曲细菌总DNA,用细菌通用引物扩增16S rDNA,并构建16S rDNA克隆文库。采用限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)技术对16S rDNA文库进行分析,获得76个克隆的酶切指纹图谱。选择酶切带型不同的阳性克隆进行测序并且构建进化树。结果表明,小曲主要细菌种类为黄单胞菌属、沙雷氏菌属、乳杆菌属、木崎氏菌属和片球菌属,其中优势细菌是以戊糖片球菌为主的乳酸菌。

瓜蒌- 薤白调节肠道菌群治疗冠心病模型大鼠的作用及机制

背景:基于网络药理学方法发现瓜蒌-薤白药对中主要生物活性化合物对冠心病有多功能作用;然而其治疗冠心病的机制尚未得到充分阐释。目的:探讨瓜蒌-薤白通过调节肠道微生物的组成改善冠心病的作用及机制。方法:40只SD大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、阳性药组、药对组,除空白组外,其余大鼠连续灌胃脂肪乳剂和注射垂体后叶素制备冠心病大鼠模型。造模后模型组大鼠灌胃蒸馏水(10 mL/kg)进行对照,阳性药组大鼠每日灌胃辛伐他汀4 mg/kg,药对组每日灌胃瓜蒌-薤白7.56 g/kg,各组大鼠给药均为14 d。观察大鼠心电图、心肌病理及血脂变化,并通过16S rDNA测序技术研究大鼠经干预后肠道微生物结构。结果与结论:①心电图结果显示模型组ST抬高;阳性药组与药对组心电图无明显问题。②与空白组相比,模型组总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇水平均显著增高(P<0.05);与模型组相比,阳性药组、药对组总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇水平均显著下降(P<0.05)。③与空白组相比,模型组局灶心肌细胞坏死;阳性药组、药对组部分心肌细胞走行紊乱。④与空白组比较,模型组、药对组及阳性药组的Ace、Shannon、Chao指数升高(P<0.05),Simpson指数降低(P<0.05);与模型组比较,阳性药组、药对组的Ace、Chao指数降低(P<0.05),Shannon指数无差异(P>0.05),Simpson指数降低(P<0.05)。⑤与空白组相比,模型组Desulfovibrionia、Muribaculaceae_norank等相对丰度升高,Clostridia、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group_norank等相对丰度降低;与模型组相比,药对组WPS-2_norank、Muribaculaceae_norank等相对丰度升高,Clostridia、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group_norank等相对丰度降低;阳性药组Desulfobacterota、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group_norank等相对丰度升高,Firmicutes、Muribaculaceae_norank等相对丰度降低;与阳性药相比,药对组Desulfobacterota、Bacteroides等相对丰度升高,Firmicutes、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group_norank等相对丰度降低;LEfSe结果发现差异显著的种群富集于药对组最多,其次是空白组、阳性药组,模型组最少。⑥结论:瓜蒌-薤白可以通过调节肠道菌群改善冠心病的发生发展,为进一步研发瓜蒌-薤白提供新的启示。

Dynamic changes of microbial community diversity in a photohydrogen producing reactor monitored by PCR-DGGE

A PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis of polymerase chain reaction) protocol was used for monitoring the dynamic changes in the microbial population during photohydrogen production. Total DNA was extracted directly from the mixed bacterial community in the reactor and subjected to PCR with V3-16S rDNA and pufM gene primers, and the amplifications were then analyzed by DGGE. The DGGE patterns demonstrated the dynamics of community structure and the shift of microbial diversity, which correspond...

传统分离培养结合PCR-DGGE技术分析传统乳制品中的乳酸菌

采用传统培养分离方法结合聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对传统乳制品中乳酸菌种群结构进行研究。结果表明:用传统分离与分子鉴定方法得到5种乳酸菌,其中,乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)为优势菌群,对通过PCR-DGGE方法得到的9条16S rDNA条带序列进行了比对,结果表明瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的丰度最高,是酸奶样品中主要的优势菌群,乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)为次优势菌群。传统分离法与PCR-DGGE技术结合能够更有效、更全面地分析传统乳制品中微生物的群落结构及优势菌群。

冷却牦牛肉贮藏过程中优势菌的PCR-变性梯度凝胶电泳分析

应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,研究托盘保鲜膜包装的冷却牦牛肉在4℃贮藏过程中的微生物多样性及其动态变化。直接从样品中提取细菌总的DNA,采用降落PCR扩增16S rDNA的V3可变区序列,再通过DGGE得到动态变化的指纹图谱,并对主要条带进行测序分析。结果表明:检测到的优势腐败菌为Pseudomonas sp.(假单胞菌)、Lactococcus sp.(乳球菌)、Acinetobacter sp.(不动杆菌)、Brochothrix thermosphacta(热死环丝菌)、Enterobacteriaceae bacterium(肠杆菌科细菌),此外还检测到Uncultured Citrobacter sp.(非培养的柠檬酸杆菌)和Staphylococcus sp.(葡萄球菌)。

16s rDNA扩增子测序分析慢性乙型肝炎患者肠道菌群的改变

目的应用16s rDNA扩增子测序技术分析慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者和健康人肠道菌群的差异,探讨肠道菌群对CHB患者疾病的影响及可能的作用机制。方法收集2017年1月—2018年12月就诊的CHB患者(60例)、健康对照者(30例)粪便样本,应用16s rDNA扩增子测序技术,进行菌群鉴定及差异性分析。结果与CHB组比较,健康对照组肠道菌群的丰富度、多样性、均匀度更高。在门水平,两组样本菌群均以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主;健康对照组出现了独有的浮霉菌门(Planctomycetes)。在纲水平,健康对照组独有Melainabacteria和OM190;芽孢杆菌纲在CHB组较健康对照组多(P=0.000 999)。在目水平,放线菌目、假单胞菌目在CHB组中独有;Gastranaerophilales在健康对照组独有;乳酸菌目在CHB组多于健康对照组(P=0.000 999);柄杆菌目、脱硫弧菌目、根瘤菌目在CHB组少于健康对照组(P=0.000 999、0.045 954、0.000 003 57)。在科水平,放线菌科、丛毛单胞菌科、莫拉氏菌科在CHB组中独有;叶杆菌科、柄杆菌科、氨基酸球菌科在CHB组少于健康对照组(P=0.000 003 57、0.000 999、0.039 96);Defluviitaleaceae、链球菌科、毛螺菌科在CHB组多于健康对照组(P=0.000 067 3、0.000 999、0.018 981)。在属水平,CHB组独有12个属,健康对照组独有5个属;CHB组毛螺旋菌属UCG-010、中慢生根瘤菌属少于健康对照组(P=0.033 966、0.000 003 57);以下菌属在CHB组多于健康对照组:瘤胃球菌属1、伊格尔兹氏菌属、毛螺旋菌属NC2004、毛螺旋菌属FCS020、梭菌属、Defluviitaleaceae UCG-011、颤杆菌克属、Blautia(P=0.009 99、0.004 995、0.030 969、0.011 988、0.027 972、0.000 067 35、0.000 969、0.019 98)。慢乙肝患者不同个体间肠道菌群差异大,健康对照组个体差异小。结论与CHB组比较,健康对照组肠道菌群的丰富度、多样性、均匀度更高。在门、纲、目、科、属等不同分类水平,CHB组和健康对照组肠道菌群有各自独有的菌种和差异菌。

大豆根瘤内生菌全细胞可溶性蛋白SDS-PAGE电泳图谱分析

以大豆根瘤内生细菌为试验材料,分别采用单次点样、重复点样、不同上样量对其进行全细胞可溶性蛋白质十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)图谱分析,根据标准蛋白质各条带相对迁移率估算待测蛋白质亚基的分子量范围,结合16S rDNA测序结果区分大豆根瘤内生菌间亲缘关系,便于后续研究。结果表明:单次点样,不同菌株间蛋白质条带有差异,说明彼此间亲缘关系不同。经16S rDNA序列分析,菌株44最相似属种为Bacillus horikoshii、菌株52最相似属种为Sinorhizobium fredii、菌株70最相似属种为Ochrobactrum intermed;重复点样,菌株7与53的蛋白质图谱相同,经16S rDNA测序分析,两者最相似属种均为Bacillus subtilis,且最相似菌株均为HRA69,说明两者属于同一种内生菌。菌株123与125蛋白质图谱相近,经16S rDNA测序比对,两者最相似属种均为Bacillus cereus;电泳结果显示,对同一菌株不同上样量不影响蛋白质图谱,16S rDNA测序结果表明同一菌株最相似属种始终不变,即不影响亲缘关系。

基于16S rDNA测序分析重组人生长激素对矮身材儿童肠道菌群的影响

目的通过16S rDNA高通量测序分析重组人生长激素(rhGH)治疗前后矮身材儿童肠道菌群的变化。方法选取初次使用rhGH治疗的3~14岁矮身材儿童作为研究对象,按照rhGH使用剂型的不同分为长效组和短效组,每组16例。长效组使用聚乙二醇重组人生长激素(PEG-rhGH)注射液,短效组使用短效rhGH注射液。分别留取2组患儿治疗前和治疗3、6个月时的新鲜粪便标本共83份,采用16S rDNA高通量测序技术结合生物信息分析技术比较2组患儿不同时点肠道菌群组成、丰度的差异及其与生长指标[胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、身高标准差积分(SDS)]的相关性。结果治疗前及治疗3、6个月时,2组Chao1指数、Pielou e指数依次升高,提示肠道菌群的丰富度、均匀度持续改善;长效组治疗3个月时Chao1指数高于短效组,差异有统计学意义(P<0.05)。置换多元方差分析(Per MANOVA)显示F=3.425、P=0.001,非度量多维尺度(NMDS)分析显示Stress值为0.17,提示rhGH可在一定程度上调节矮身材儿童肠道菌群组成和结构。随着rhGH使用时间的延长,2组拟杆菌门、拟杆菌属的丰度和拟杆菌门与厚壁菌门比值(B/F)均逐渐上升,其余优势菌群的丰度呈现波动性变化,差异无统计学意义(P>0.05)。相关性分析显示,长效组治疗6个月时IGF-1、身高SDS均分别与拟杆菌门、拟杆菌属、B/F呈正相关,短效组治疗6个月时IGF-1与拟杆菌门、拟杆菌属、B/F均呈正相关,短效组治疗3个月时IGF-1、身高SDS与双歧杆菌属呈正相关。功能预测结果显示,肠道菌群主要参与碳水化合物代谢和氨基酸代谢等途径。结论rhGH能够改善矮身材儿童肠道菌群的组成和丰度,短期内PEG-rhGH在改善肠道菌群丰富度方面相较于短效rhGH具有一定优势,rhGH能增加有益菌丰度而发挥协同促生长作用。

ε-聚赖氨酸生产菌株的筛选和鉴定

建立了一种灵敏的ε-PL产生菌高通量的筛选方法。在分离培养基中加入150mg/LK2Cr2O7,以有利于放线菌的富集分离;并添加美蓝染料,利用产碱菌株碱性分泌物和美蓝之间的静电作用而形成独特的透明圈,从而灵敏地筛选得到产碱菌株;利用Dragendorff试剂与生物碱特有的颜色反应从产碱菌株中检出得到46株生物碱产生株;最后对产生物碱的菌株的发酵液进行ε-PL含量分析,确定4株ε-PL产生菌株。对其中一株ε-PL高产菌PL6-3菌株进行形态、生理生化和16SrDNA分析,结果表明PL6-3为北里孢菌属(Kita-satospora)。

1,2,4-三氯苯降解菌的分离及其降解质粒的研究

以1,2,4-三氯苯为唯一碳源,从天津化工厂氯苯生产车间的土壤中分离到1株1,2,4-三氯苯的降解菌THSL-1.通过形态观察和16SrDNA序列测定,该菌株被初步鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri).经质粒检测,在菌株THSL-1中发现1条质粒条带,将所获得质粒转化到E.coli.JM109中,转化子能以1,2,4-三氯苯为唯一碳源生长,且对1,2,4-三氯苯有降解作用.因此,可以认为该质粒携带降解1,2,4-三氯苯的基因.选用HindIII、BamHI、XholI3种限制性内切酶分别对质粒pTHSL-1进行单酶切、双酶切,最终确定质粒平均大小为40.2kb.

苯酚降解菌F5-2的分离鉴定及其降解特性

采用逐量分批驯化方法，从某造纸厂的废水中分离得到一株能够以苯酚为唯一碳源生长、可高效降解苯酚的菌株F5-2。通过形态学、生理生化特征和16SrDNA序列分析，F5-2鉴定为节杆菌（Arthrobactersp．）。该菌株的细胞生长与苯酚降解能力呈同步趋势，苯酚降解主要发生在生长对数期。该菌株最高可耐受1500mg．L-1的苯酚，在温度20--40℃、pH5．0-9．0、摇床转速200r．min-1、盐度0-40g．L-1范围内，F5-2菌株均能保持对苯酚良好的降解能力。菌种接种量在2％时苯酚降解率达到最大：反应57h后，可使800mg．L-1的苯酚降解率达96．13％。F5-2菌株降解苯酚的功能酶是邻苯二酚2，3-双加氧酶，该酶为胞内酶，其表达受苯酚诱导，通过间位开环降解苯酚。

转糖基β-半乳糖苷酶产生菌筛选和鉴定及酶催化生成低聚半乳糖

通过水解活性和转糖基活性筛选,从实验室97株保存菌种中获得1株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,克隆并序列分析了该菌株16S rDNA基因片断,GenBank收录号为DQ267829.综合其形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析结果,将其鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)2-37-4-1.确定了该菌株β-半乳糖苷酶产酶培养基的碳源为乳糖1%,氮源为蛋白胨0.5%和酵母膏0.5%,培养条件为37℃摇床培养18 h;碳源实验证明,该菌株β-半乳糖苷酶产生为乳糖诱导型.利用薄层层析技术研究了pH值、乳糖底物浓度、反应温度和反应时间对该菌株β-半乳糖苷酶以乳糖为底物转糖基合成低聚半乳糖的影响,确定最适反应条件为pH7.5、50 mmol/L(磷酸缓冲液)配制的40%乳糖溶液,55℃反应24 h.转糖基反应产物高压液相色谱分析其组成为低聚半乳糖25.68%,双糖(包括乳糖和转移二糖)33.02%,葡萄糖26.37%和半乳糖14.92%.

一株产胞外中性β-葡萄糖苷酶菌株的鉴定及酶学特性研究

从碱性土壤中分离筛选得到一株产胞外中性β-葡萄糖苷酶的菌株ZL-110。采用16SrDNA序列分析方法对其进行分子学鉴定,结果表明,其在分类学地位上归属于芽孢杆菌属。采用SDS-PAGE方法测得该β-葡萄糖苷酶的分子量约为43kD。酶学特性研究结果表明,该酶以水杨酸苷为底物时,最适pH值与最适温度分别为7.0和50℃,是一种中性酶,具有较好的热稳定性。