应用变性梯度凝胶电泳和16SrDNA序列分析对山羊瘤胃细菌多样性的研究

以取自3头安装有永久性瘤胃瘘管的土种山羊的瘤胃内容物为材料,经过DNA抽提和PCR扩增,扩增产物利用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE,一种DNA指纹技术)分析瘤胃细菌在两种日粮条件下的多样性.同时利用基因序列分析技术,分析了16个在DGGE胶上有匹配带的克隆的16S rDNA序列,并与现有的数据库进行了比较.结果表明,饲喂基础日粮时3头山羊瘤胃内容物的DGGE图谱有一定的相似性(43%～55%);饲料中添加大豆黄酮一定程度上影响了瘤胃细菌的组成,DGGE 谱带变化程度分别为 1 号 36% 、2 号 46% 、3 号 30%。基因序列分析表明,DGGE图谱中优势条带的16S rDNA基因序列中有5个基因序列与基因数据库登录的相关序列的相似性大于97%,8个基因序列的相似性在90%～96%,余下的低于90%。相似性大于97%的5个克隆中,只有1个被鉴定为Prevotella sp .,其余 4 个都属于未被鉴定的瘤胃细菌。

检测藻类16SrDNA特异性片段在溺死诊断中的应用

目的建立藻类16Sr DNA特异性片段扩增方法,探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法 35只实验兔随机分组:生前入水组(溺死组)15只,死后入水组(空气栓塞致死后入水)15只,对照组(空气栓塞死后不作处理)5只;微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测过的20例水中尸体肝脏样本20份(硅藻阳性14份,阴性6份)。7种已知藻(直链藻、菱形藻、针杆藻、舟形藻,铜绿微囊藻,小环藻,小球藻)作为对照。提取组织样本及藻类DNA,扩增产物银染显带。结果生前入水组肺、肝、肾检出率分别为100%,86%,86%;死后入水组肺、肝、肾检出率分别为13%,0%,0%。对照组肺、肝、肾藻类未检出。生前入水组与死后入水组各种脏器中藻类检出率差异显著(P<0.05)。20份经微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测的水中尸体肝脏样本中,使用本方法15份样本结果为阳性(包括1份硅藻阴性样本)。7种藻类DNA扩增结果为阳性。结论本文所建立的PCR法检测藻类16Sr DNA灵敏度高,可对多种溺死藻类同时检测,有较好的应用前景。

MALDI-TOF MS与16SrDNA方法对肠杆菌科微生物鉴定比较分析

为了研究基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)法鉴定肠杆菌科微生物及其对微生物系统分类学相关分析的准确性,采用MALDI-TOF MS对金桔表面分离的10种肠杆菌科微生物进行蛋白质图谱收集,通过比对图谱特征峰实现微生物的鉴定与系统进化学分析;同时对10种微生物进行16SrDNA提取与测序,得到分子生物化学水平鉴定,并采用邻近连接法对16SrDNA序列做系统进化树分析。结果表明:MALDI-TOF MS与16SrDNA测序对10种肠杆菌科微生物鉴定结果中,克雷伯菌属2株菌鉴定种级有偏差,其他8种一致;MALDI-TOF MS与16SrDNA测得的数据都可计算微生物相关性,从而得到微生物系统发育树,两株系统发育树中同属级微生物归类的亲缘位置与方向一致,但不同属肠杆菌科微生物的亲缘距离与位置差异较大。MALDI-TOF MS法鉴定农产品表面微生物具有快速、准确的特点,但准确建立系统发育相关性还需要扩大数据库和优化算法。

16SrDNA同源性所揭示的双歧杆菌与有关细菌的亲缘关系

本研究测定了低GC含量的双歧杆菌 (Bifidobacteriuminopinatum )和新种B .thermaci dophilum的 16SrDNA全序列 ,在同另外 19个双歧杆菌及 8个相关细菌的 16SrDNA同源性分析的基础上构建了系统发育树。结果表明 :除低GC含量的B .inopinatum外 ,所有双歧杆菌的种在 16SrDNA序列相似性≥ 92 %的水平上聚类为一个簇群。尽管B .inopinatum与其它种的双歧杆菌的相似性只有87%～ 89% ,但它仍与双歧杆菌的关系最密切 ,而并未显示出与GC含量相近属的特殊亲缘关系。本研究结果未显示出在革兰氏阳性细菌分支中 ,由低GC到高GC含量的细菌种群的系统演化模式。此外 ,研究结果提示在细菌系统发育研究中 ,由 16SrDNA序列和基因组DNA同源性产生的矛盾需借助于其它保守的生物大分子来澄清。

油茶根际联合固氮菌的16SrDNA全序列分析

利用16SrDNA序列系统发育学分析方法对从湖南省野生油茶根系分离筛选出的一株高效联合固氮菌株B7-7进行了系统分类研究。结果表明:该菌株与鞘脂菌属Sphingobium yanoikuyae的同源性和相似性均达到99%,结合B7-7的形态特征和生理生化特性,初步将其确定为鞘脂菌Sphingobium sp.。

基于16SrDNA序列的中国沿海短蛸种群遗传结构

采用线粒体基因测序技术,对中国沿海7个短蛸(Octopus ocellatus)群体的遗传结构和变异进行分析,以探讨种群扩散潜力对遗传结构的影响。共测定了100个短蛸样本的485 bp的16S rDNA序列,经UPGMA聚类分析表明,中国沿海的短蛸群体存在着明显的种群结构。7个群体明显地分化为两大类群:一个类群由北方沿海的大连、烟台、青岛、连云港群体组成,另一个类群由南方沿海的上海、舟山和广东群体组成;两类群间存在14个固定核苷酸碱基的替换。两类群间的遗传分化系数FST和基因流Nm分别达0.878和0.069,并达到显著分化水平(P<0.05)。AMOVA检验表明,两类群间的差异有87.76%存在于群体间,而仅有12.24%存在于群体内。两类群间的净遗传距离为0.019,表明可能为中度的种内群体间分化水平。依据分子钟理论推断,两类群的分化时间约为晚更新世冰期。两类群的分化可能与短蛸缺乏浮游幼体生活史和无长距离迁移习性有关,基因流与地理距离间的相关性符合脚踏石模型,进一步证实了这一点。同时短蛸群体的这种分化格局还可能与晚更新世以来中国沿海海平面的反复升降和长江口淡水的阻隔有关。

竹丛枝植原体16SrDNA片段克隆与序列分析

利用植原体16SrRNA基因序列设计合成的引物,对表现丛枝的竹子植株总DNA进行直接PCR及巢式PCR扩增,得到长1.2kb的目的片段。将此片段与pGEMTEasy载体连接并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。通过酶切、PCR鉴定,对筛选得到的重组阳性克隆进行核酸序列测定及同源性比较分析,结果表明其与植原体16SrⅠ组中的西方翠菊黄化植原体(SAY)同源率为99%。依据16SrDNA序列建立了竹子丛枝病植原体株系的系统进化树。对云南竹子丛枝病植原体株系分类鉴定与已报道的结果相似。

假臭草丛枝病植原体16SrDNA检测与PCR-RFLP分析

采用PCR技术对假臭草丛枝病原进行分子检测及巢式PCR扩增,得到1189bp的植原体16SrDNA片段,将该片段进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析,并将与已知的植原体序列共同构建系统发育树,试图明确其与已知植物原体种类的关系,为进一步研究打下遗传基础。结果显示出所检测假臭草病株样品感染同种类型的植原体。直接PCR产物纯化后直接测序,序列显示出与16SrII组植原体有较高的同源性,假臭草丛枝病与植原体16SrII组中的花生丛枝病、番薯丛枝病和中国木豆丛枝病同源率最高,达到98.5%,因此可以认为假臭草丛枝病植原体属于16SrII组,即花生丛枝病组(PnWB)。

一株高产脂肪酶产生菌16SrDNA的序列分析

【目的】对分离获得的高产脂肪酶菌株进行鉴定,为其改造和更好利用奠定基础。【方法】对从食堂下水道中分离获得的一株高效产脂肪酶细菌(JLП-4)进行培养,提取其基因组DNA。设计16SrDNA通用引物,扩增16SrDNA基因片段,并连接到pUC19-T载体上,转化大肠杆菌DH5X,经PCR鉴定的阳性克隆摇菌培养后测序。【结果】提取获得较高质量的基因组DNA,扩增获得新分离菌株16SrDNA基因片段,长度为1528bp,BLAST相似性比对分析结果表明,其与伯克霍尔德氏菌16SrDNA序列相似性达97%,是一株与伯克霍尔德氏菌最近的革兰氏阴性菌。【结论】初步将高产脂肪酶细菌JLП-4鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌。

耐热脂肪酶产生菌FS1403的分离筛选和16SrDNA基因序列的分析

从菲律宾火山口土样中分离、筛选获得一株产脂肪酶的耐热菌FS1403，对该菌脂肪酶的酶学性质初步研究表明：酶的最适作用温度为55℃，60℃处理1h保持70％酶活性，为中度耐热脂肪酶。酶的最适pH值为8．0，在pH7～pH10的条件下酶活都比较稳定。采用细菌16SrDNA通用引物，PCR扩增、克隆并分析了该菌的16SrDNA基因序列，同源性和系统发育学分析表明菌株FS1403与Bacillus subtilis具有最紧密亲缘关系。

广东茄科雷尔氏菌16SrDNA序列分析

应用PCR方法,获得了分离自广东番茄、茄子、辣椒、烟草、空心菜、沙姜、姜、马铃薯、花生、菊花、桑树和藿香共12种作物21个茄科雷尔氏菌菌株的16S rDNA.序列测定及比较结果表明,21个广东茄科雷尔氏菌菌株16SrDNA近全长序列均为1 528 bp,序列间同源率99.2%-100%;各菌株的16S rDNA序列间只有1-12个不等的碱基差异,其中20个菌株的458-460位及474位的碱基是ACT和T,而菌株HZ-1则是TTC和A,说明广东茄科雷尔氏菌的16S rDNA序列十分保守.系统进化分析结果显示,仅菌株HZ-1聚类于茄科雷尔氏菌2 a亚组中,其余20个菌株均聚类于茄科雷尔氏菌区组1中.

不同症状矮牵牛植株植原体16SrDNA片段的克隆及序列分析*

应用植原体 16SrRNA基因通用引物,分别对表现矮化和扁茎症状的矮牵牛植株进行巢式PCR检测,均得到约 1. 2kb的特异片段。将此特异片段与pGEM -TEasy载体连接并转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中,通过PCR鉴定,序列测定及同源性比较分析,结果表明:这 2个植原体株系 16SrDNA片段G+C含量分别为47. 1%和 47. 0%,具有其他柔膜菌纲原核生物 16SrRNA基因碱基组成特征;与 16Sr组中的代表株系 (西方翠菊黄化,SAY)同源率达到最高,分别为 99. 1和 98. 6%,故认为这 2个株系为该组成员之一。

β-环状糊精葡萄糖基转移酶发酵染菌的分离和16srDNA分析

目的:解决β-环状糊精葡萄糖基转移酶发酵生产过程中频繁出现的不明原因的酶活降低问题。方法:我们采用特异性酚酞筛选培养基对发酵异常的发酵液进行菌种分离,对分离得到的菌株进行16 srDNA基因序列分析,同时研究他们的发酵过程中光密度、酸碱度、酶活指标。结果:分离得到了一株可以在碱性条件下与正常生产菌共生的芽孢杆菌。经过对发酵过程进行研究,在不同的发酵时期中该菌的光密度的变化和正常生产菌有明显差异,最终酶活仅为正常菌的1/6。通过对16 srDNA基因序列进行分析,确定其为芽孢杆菌,和正常生产菌基因相似度达到93.81%。结论:在生产中采用16 srDNA基因序列分析,可以排除染杂的的生产菌种。只要严格控制发酵出发菌株和严格保证发酵环境的纯培养条件,可以防止染菌的发生。

致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌的分离与16SrDNA的鉴定

从鹅卵黄性腹膜炎临床病例中采集样品,分离病原进行一系列生化鉴定,共分离得到7株致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌,编号为E0238、E0239、E0240、E0453、E0454、E0241、E0245。O血清型鉴定分属于O2、O21、O37、O1、O24、O24、O148。利用16SrDNA扩增试剂盒对随机选取的3株细菌进行PCR扩增,并将PCR产物序列与GenBank中的E.coli16SrDNA进行序列比对,结果显示分离细菌与大肠杆菌的同源性达99%以上。

油茶内生拮抗细菌Y13菌株16SrDNA序列分析及抑菌机理研究

为了确定与分析Y13的亲缘关系及其抑菌机理,以一株对油茶炭疽病有生物防治效果的内生拮抗细菌Y13为研究对象,对其16S rDNA序列进行了分析,并对其抑菌机理作了初步的研究。结果表明:菌株Y13 16SrDNA全长共1 475 bp,菌株Y13与芽孢杆菌属菌株的同源性较高,通过Clustalw,Y13菌株和B.subtilis的亲缘关系最近,最终确定Y13菌株为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌;Y13对油茶炭疽病病菌菌丝有抑制、致畸作用,且能抑制分生孢子的萌发,同时培养的滤液对热、酸碱的抑菌作用较为稳定。

16SrDNA克隆文库法分析拜城油鸡盲肠细菌多样性研究

为了研究拜城油鸡盲肠细菌物种多样性,本研究采用基于16SrDNA基因序列系统发育分析的免培养方法进行细菌物种多样性分析,以盲肠内容物样品总DNA为模板,利用细菌通用引物扩增16SrDNA基因,构建16SrDNA基因克隆文库,并对文库中的插入序列进行RFLP分析。结果表明:随机挑选的252个克隆为阳性克隆,阳性率为65.7%,经过RFLP筛选出95个不同图谱的重组克隆并测序,比对分析后发现:拜城油鸡盲肠细菌分属于厚壁菌门(Firmicutes)(65.26%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)27.37%)和变形菌门(Proteobacteria)(4.21%)。在纲水平有梭菌纲(Clostridia)、拟杆菌纲(Bacteroidia)和ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)相对含量最多,分别占总菌的64.21%、26.32%和4.21。在科水平上以瘤胃菌科(Ruminococcaceae)(21.05%)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)(20%)和理研菌科(Rikenellaceae)(12.63%)相对含量最多,为优势科。在属水平上仅有31.58%的序列可以鉴定到属,Lachnoclostridium的相对含量最多,占总菌的12.63%,其次为另枝菌属(Alistipes)和瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)。拜城油鸡盲肠内容物中的细菌组成具有丰富的多样性,并有新细菌分类单位的潜在资源,值得进一步进行开发研究。

沙坡头地区根瘤菌DNA同源性及16SrDNA全序列

数值分类和多位点酶电泳分析表明，分离自宁夏沙坡头地区的１２株根瘤菌构成一个独立的表观群。对这一菌群进行了ＤＮＡ同源性和群内中心菌株１６ＳｒＤＮＡ全序列分析。１２个菌株的Ｇ＋Ｃｍｏｌ％在５６４～６２２范围内；群内ＤＮＡ同源性为７２３％～９３５％，大于７０％，属种内水平；中心株Ｎ２２０的１６ＳｒＤＮＡ全序列与参比菌株的序列比较，从模拟系统发育树看出，它与三株土壤杆菌、三株根瘤菌的１６ＳｒＤＮＡ序列同源性在９４８％～９９２％的相似性水平上构成一个分支，看来沙坡头地区这群根瘤菌是一个独立的新种群。

我国中东部地区紫穗槐、紫荆、紫藤根瘤菌的数值分类及16SrDNA PCR-RFLP研究

从分离自我国中东部地区紫穗槐、紫荆和紫藤 3种宿主根瘤菌中 ,选取 5 9个菌株和 2 9个参比菌株 ,对它们进行了 135个表型性状测定的数值分类分析和 16SrDNAPCR RFLP研究。试验结果表明 ,数值分类聚类在82 %相似性水平上、16SrDNAPCR RFLP聚类在 92 %相似性水平上均聚为 7个群 ,各宿主根瘤菌基本上按参比菌株各属归群。其中绝大多数紫穗槐根瘤菌归属于中慢生根瘤菌属 ,而且在种水平上表现出一定程度的地理环境多样性 ;紫荆根瘤菌基本上属于慢生根瘤菌属 ,在分群方面未表现出明显的地区差异 ;而紫藤根瘤菌则基本上归属于快生菌。其中来自江、浙地区的紫藤根瘤菌与来自其它地区的紫藤根瘤菌存在着明显的地理环境差异 ,并且紫藤根瘤菌较其它 2种宿主根瘤菌表现出较强的抗逆能力 ,如能够耐某些高浓度 (30 0 μg·ml-1)的抗生素 ,可在高盐环境 (3%NaCl)和强碱环境 (pH 11.0 )下生长。这将为我国进行荒山造林、扩种豆科树种提供有意义菌种。另外 ,数值分类结果亦表明 ,以紫穗槐根瘤菌为代表的群 2、以紫荆根瘤菌为代表的群 5和以紫藤根瘤菌为代表的群 7在种水平上均独立成群 。

布氏菌分离株16SrDNA基因遗传进化分析

目的检测内蒙古布氏菌临床分离株的16SrDNA基因序列,构建16SrDNA遗传进化树,确定该菌株的分类地位。方法用BCSP31-PCR对临床分离株检测,再进行16SrDNA双向测序;从GeneBank下载标准参考菌株和与布氏菌有共同抗原细菌的16SrDNA基因序列;用Mega6.0进行序列比对并构建遗传进化树。结果 BCSP31-PCR结果显示均有223bp扩增条带,16SrDNA测序得到单一基因序列;比对后发现有4处特异片段,经Blast比对,位于844-1224包括380bp的片段为布氏菌独有;进化树显示布氏菌临床分离株与标准菌株聚在1个末端分支上,遗传距离接近0,无法精细区分相互关系;与人苍白杆菌聚集在1个亚分支上,遗传距离0.019;与其它试验菌株如霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔菌遗传进化距离较远,遗传距离>0.02。结论从遗传进化角度对布氏菌分离株与标准菌株的亲缘关系进行分析,布氏菌所有种型遗传距离接近,提示布氏菌16SrDNA为高度保守序列,不宜做遗传进化分析的靶基因;布氏菌与人苍白杆菌有较近的亲缘关系;布氏菌属16SrDNA特有的380bp的基因片段可作为布氏菌快速鉴定的靶序列。