一种新型诱变技术在Vc前体(2-KLG)产生菌遗传改良中的作用

研究了低能离子注入 2 酮基 L 古龙酸 (2 KLG)生产菌的生物学效应。结果表明能获得较高的突变率和较广的突变谱。比较了三种离子注入 2 KLG生产菌的差异 ,确定了最佳诱变剂量和最适注入离子。由此筛选出若干高产突变株 ,其糖酸克分子转化率高达 97% ,目前已通过工业化生产实验 ,取得了显著的经济效益。

低能离子注入介导Vc前体(2-KLG)产生菌DNA的转导

对低能离子注入2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)生产菌的生物学效应和注入离子对DNA的损伤效应进行了初步研究。并以离子注入为介导将外源DNA转入2-KLG产生菌中,最终得到两株DNA重组菌。由此建立起离子注入介导微生物外源DNA转导的研究体系,为微生物转基因工程提供了一条新的途径。

2-KLG产生菌混合发酵特性及最佳混生模式的研究

氧化葡萄糖酸杆菌合成的2－KLG对巨大芽孢杆菌的生长繁殖具有明显的抑制作用，可缩短其生长周期。发酵体系中巨大芽孢杆菌的存在是氧化葡萄糖酸杆菌的生长繁殖和合成2－KLG所必需的，发酵过程中巨大芽孢杆菌裂解所释放的活性物质可能是刺激氧化葡萄糖酸杆菌合成2－KLG的主要原因。二菌混合发酵需在适宜的混生模式下才可达到最佳效果。

微生物混合培养从D山梨醇产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸

氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacteroxydans)SCB3 2 9以D 山梨醇为底物培养时可产生微量 2 酮基 L 古龙酸 ;而葡萄糖酸杆菌 (Gluconobactersp .)SCB1 1 0能将D 山梨醇以较高效率转化为L 山梨糖 ,但不产 2 酮基 L 古龙酸。将两种微生物在以山梨醇为底物的培养基中混合培养 ,其代谢产物经分离提纯后进行熔点测定、元素分析、红外吸收光谱测定等 ,确定其主要的代谢产物是 2 酮基 L 古龙酸。

从D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸——Ⅰ.菌株的诱变选育和代谢产物的鉴定

2-酮基-L-古龙酸是合成维生素C的前体,以D-葡萄糖为原料经两种微生物串联发酵直接制备。本文报道了用紫外线照射和硝基胍处理等方法对2-酮基-L-古龙酸及其中间体2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)产生菌的诱变选育。葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter sp.)SCB 611在含D-葡萄糖、玉米浆和碳酸钙的培养基中,经48小时培养后,可生成2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)。同时也选出了一株欧文氏菌(Erwinia sp.)SCB 247,它的产酸能力比前者明显要高。棒状杆菌(Corynebacterium sp.)SCB 3058在以D-葡萄糖作为氢载体的情况下,经过三天摇瓶发酵,能将经SDS处理的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)有效地转化为2-酮基-L-古龙酸。上述菌株的代谢产物经分离提取后用熔点测定、元素分析、红外和紫外吸收光谱测定等鉴定,可以确证菌株SCB 611或(SCB 247)及菌株SCB 3058的代谢产物分别是2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)和2-酮基-L-古龙酸。

D-葡萄糖串联发酵产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸——I.产酸新菌株SCBl25产生中间体2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)发酵条件的研究

维生素C(Vitamin C,简称Vc),又称L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid)是人体必需的维生素,生理作用广泛,在医药和食品工业上均有重要地位。目前国内厂家多以我国发明的“二步发酵法”进行生产,即以D-山梨醇为原料生产2-酮基-L-古龙酸(以下简称2-KLG),然后制备维生素C。而近年来引起国内外普遍关注的是从D-葡萄糖串联发酵生产2-KLG的新工艺,以及采用基因工程技术,构建直接由D-葡萄糖转化生成2-KLG的基因工程菌的研究(图1)。1987年以来我国学者尹光琳等人采用了欧文氏菌(Erwinia sp.)和棒状杆菌(Corynebacterium sp.)进行串联发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸,并开展了一系列的研究。

2-酮基-L-古龙酸的高效液相色谱测定方法和条件

为了快速准确的检测维生素C（VC）生产工艺中VC的重要前体物2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）浓度,采用高效液相色谱法进行测定,选用6×250 mm Carbohydrate分析柱,乙腈：磷酸二氢钾=60∶40的流动相,在波长210 nm处紫外光检测,控制流速为1 mL/min和温度45℃。结果表明2-KLG在6 min左右出峰,与VC具有较好分离度;2-KLG标准曲线的回归方程为y=0.776x-13.46,相关系数达到99.9%,检出限为0.5 mg/L;回收率为96.3%~104%,RSD为6.28%（n=5）

构建基因工程菌发酵产生维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸

从棒状杆菌SCB30 5 8克隆得到两个 2 ,5 DKG 还原酶基因后 ,构建了两个能够表达 2 ,5 DKG还原酶的基因工程大肠杆菌BL2 1 (DE3)PET9aⅡ和DH5α( pBL4)和一个基因工程欧文氏菌ER97。 2 ,5 DKG还原酶基因分别受控于PL 或T7启动子 ,通过加入IPTG或提高温度进行诱导 ,SDS PAGE和酶活测定确定它们在诱导后得到了高表达 ,用细胞抽提液在加入辅酶NADPH的体外实验中转化 2 ,5 DKG ,HPLC检测证明能够产生大量 2 KLG ,然后在摇瓶水平上研究了它们转化 2 ,5 DKG产生 2 KLG的能力 ,结果表明采用合适的培养基 ,经过适时的诱导 ,它们都能够转化 2 ,5 DKG产生 2 KLG ,它们的产量可能与细胞内NADPH水平、2 KLG跨膜转运以及还原 2 KLG的酶水平有非常直接的关系。进一步提高产量需要对培养基和发酵条件进行优化。

维生素C发酵新工艺中2-氧代-L-古洛糖酸发酵液絮凝处理研究

将絮凝技术应用于Ｄ－葡萄糖直接串联发酵产生维生素Ｃ前体——２－氧代－Ｌ－古洛糖酸（１）这一新工艺中第二步菌株（即能将中间体２，５－二氧代－Ｄ－葡萄糖酸转化为１的棒状杆菌ＳＣＢ３０５８）发酵液的处理。系统研究了絮凝处理的最适条件。实验结果表明，絮凝剂的种类和浓度、处理过程中的ｐＨ值和温度，是影响絮凝效果的关键因素。将发酵液用适当的絮凝剂在浓度２０００ｐｐｍ、ｐＨ７．００和温度４０°Ｃ的条件下处理４ｈ所除去的固体杂质比用离心法多４．２５倍。

2-酮基-L-古龙酸的高效液相色谱分析

目的:鉴定发酵液中的产物是2-酮基-L-古龙酸(2-KLG);方法:用高效液相色谱(HPLC)法测定氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)混合发酵液中的2-KLG。采用Aminex A 27柱46×250mm;流动相为十二烷基硫酸钠(0.01mol/L)/乙腈(3%)=2/3,流速1.0mL/min,柱温30℃;用L-7420 UV检测器检测。同时还研究了流速对检测的影响。结果:该方法回收率为94.21%,RSD为4.2%。

2-酮-L-古洛酸的补料分批发酵的研究

通过对２－酮－Ｌ－古洛酸的一般发酵与补料分批发酵过程比较研究，发现了补糖分批发酵的一些表观特征，为其发酵控制提供了依据。

D-葡萄糖串联发酵产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸——Ⅱ.菌株SCB3058产生2-酮基-L-古龙酸发酵条件的研究

维生素C(Vitamin C,简称Vc),又称L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid)是人体必需的维生素,生理作用广泛,在医药和食品工业上均有重要地位。目前国内厂家多以我国发明的“二步发酵法”进行生产,即以D-山梨醇为原料生产2-酮基-L-古龙酸(以下简称2-KLG),然后制备维生素C。而近年来引起国内外普遍关注的是从D-葡萄糖串联发酵生产2-KLG的新工艺,以及采用基因工程技术,构建直接由D-葡萄糖转化生成2-KLG的基因工程菌的研究(图1)。1987年以来我国学者尹光琳等人采用了欧文氏菌(Erwinia sp.)和棒状杆菌(Corynebacterium sp.)进行串联发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸,并开展了一系列的研究。

间歇流加L-山梨糖发酵生产2-酮基-L-古龙酸研究

利用氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobact eroxydans)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)混合菌系及自动控制温度、pH和溶氧系统,在发酵过程中间歇流加L-山梨糖发酵生成2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)。结果表明:间歇流加L-山梨糖可以解除高浓度糖对产酸的抑制作用,提高了糖的转化率,当将L-山梨糖的终浓度调高到14%(w/V)时,2-KLG产量为130 mg/mL左右,转化率达90%,发酵周期40～60 h之间,发酵周期略有延长。

欧文氏菌SCB125中2-酮醛糖酸还原酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

根据酶活测定和 PAGE活性染色初步证明欧文氏菌 SCB12 5中存在酶活较高的 2 -酮醛糖酸还原酶 (2 - KR) ,能够以 2 ,5 -二酮 - D-葡萄糖酸 (1)、2 -酮 - L -古洛糖酸 (2 )或者 2 -酮 - D-葡萄糖酸 (3)为底物。抽提欧文氏菌染色体DNA为模板 ,利用 PCR技术扩增 ,克隆得到两个 2 - KR酶基因 (tkr A和 tkr B) ,通过酶切和测序证明 :2 - KR A基因发生多处突变 ,而 2 - KR B基因保守。将含有这两个基因的片段分别连接到表达载体 p BL并转化大肠杆菌 DH 5α后 ,均获得高酶活表达。如果进一步用基因剔除的方法破坏欧文氏菌染色体上野生型 2 - KR基因 ,可以获得一个表达 1还原酶的理想宿主 ,为实现从葡萄糖一步发酵生产维生素 C前体

L-山梨糖脱氢酶的纯化及性质的研究

从５Ｌ罐发酵Ｌ－山梨糖的Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ＳＣＢ３２９和Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＳＣＢ９３３混合菌株中差速离心收集ＳＣＢ３２９菌体，破碎，离心获得无细胞抽提液，硫酸铵分级沉淀蛋白后依次经ＤＥＡＥＣｅｌｌｕｌｏｓｅ ５２和Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ柱层析分离得到了Ｌ－山梨糖脱氢酶（ＳＤＨ），它能将Ｌ－山梨糖脱氢氧化为Ｌ－山梨酮，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳测得分子量约为６０ＫＤ。动力学性研究表明它为一个典型的Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ氏酶，对Ｌ－山梨糖作用的Ｋｍ值为 ５２．７ ×１０－３ｍｏｌ／Ｌ，对ＤＣＩＰ作用的Ｋｍ值为 ２．０６ × １０－３ｍｏｌ／Ｌ，最适作用ｐＨ和温度分别为７．０和４２℃。Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋是酶的激活剂，Ｃｕ２＋是酶的抑制剂，ＥＤＴＡ对该酶也有明显的抑制作用。不同碳源对酶活的影响研究表明它在ＳＣＢ３２９中是组成型表达。