转2-CysPrx基因烟草抗氧化酶和PSII电子传递对盐和光胁迫的响应

以转2-Cys Peroxiredoxins(2-Cys Prx)基因的烟草(Nicotiana tabacum)为材料,非转基因烟草为对照,调查盐和光胁迫对转基因烟草幼苗叶片抗氧化酶和叶绿素荧光特性的影响,揭示2-Cys Prx基因在植物抗逆方面的功能。结果表明,弱光(200μmol m 2s 1)下,随着盐浓度增大,转基因烟草和对照的SOD活性皆增加,APX活性变化不大,H2O2含量稍有升高;强光(1000μmol m 2s 1)下,随着盐浓度增大,转基因烟草SOD活性增强,APX活性下降,H2O2含量增加缓慢,而对照的H2O2含量迅速升高,转基因烟草叶片的PSII电子传递速率(ETR)、最大光化学效率(Fv/Fm)和实际光化学效率(PSII)均高于对照,而且PSII电子受体侧的受抑制程度明显低于对照。结果暗示在强光和盐胁迫使APX活性降低的情况下,2-Cys Prx可有效清除细胞中过量H2O2,增强光合电子传递链的稳定性,特别是PSII电子受体侧的电子传递,有效减轻盐和高光胁迫引起的PSII光抑制。

过表达和抑制表达2-Cys Prx基因烟草的生长、生理特性和叶片光合功能对模拟酸雨的响应

为揭示2-Cys Peroxiredoxins(2-Cys Prx)基因在烟草龙江911抗逆中的功能,以过表达2-Cys Prx基因烟草、抑制表达2-Cys Prx基因烟草和非转基因烟草幼苗为试材,研究了不同pH值的模拟酸雨对其生长指标、叶片生理生化特性和叶片光合生理的影响。结果表明:与对照相比,pH值4.0的模拟酸雨对3种基因型烟草的株高、叶面积、比叶重无明显影响,pH值2.5的模拟酸雨处理下,与对照相比,过表达2-Cys Prx基因烟草幼苗的株高无明显变化,抑制表达2-Cys Prx基因烟草和非转基因烟草幼苗的株高显著降低;随着模拟酸雨pH值降低,3种基因型烟草叶片的硝酸还原酶(NR)活性、可溶性蛋白含量、SOD和APX活性、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、实际光化学效率(ФPSⅡ)、光化学猝灭系数(qP)、光系统Ⅱ潜在光化学效率(Fv/Fo)和细胞膜稳定指数逐渐下降,非光化学猝灭系数(qN)和H_2O_2含量逐渐增加,但在相同pH值的模拟酸雨处理下,过表达2-Cys Prx基因烟草各项生理指标均优于抑制表达2-Cys Prx基因烟草和非转基因烟草幼苗。由此可知,增强2-Cys Prx基因在烟草中的表达可能提高烟草在模拟酸雨处理下的硝态氮利用能力,并在模拟酸雨处理造成APX活性下降时,清除叶绿体中的H_2O_2,使光合电子传递链保持稳定,增强烟草叶片的光合能力。

不结球白菜过氧化还原蛋白基因Brc2-Cys Prx的克隆和表达分析

[目的]双半胱氨酸型硫氧还蛋白过氧化物酶Brc2-Cys Prx是过氧化还原蛋白Peroxiredoxins(Prxs)的亚家族。Prxs是植物抗氧化酶防御系统的成员,对清除植物体内活性氧具有重要作用。本文旨在克隆和研究Brc2-Cys Prx基因在不结球白菜处于不同胁迫条件下的表达模式。[方法]以不结球白菜霜霉病抗病自交系‘苏州青’和霜霉病感病自交系‘矮脚黄’为试验材料,利用RACE技术克隆得到不结球白菜Brc2-Cys Prx基因。利用生物信息学方法对该基因进行信息学分析。采用qRT-PCR技术对不结球白菜叶片Brc2-Cys Prx基因在霜霉病菌侵染及NaCl、CdCl_2、PEG6000和ABA等非生物胁迫处理条件下的表达模式进行研究。[结果]Brc2-Cys Prx基因的c DNA全长为999 bp,其中开放阅读框长度为810 bp,共编码270个氨基酸。该蛋白不存在信号肽序列,预测相对分子质量为28.15×10~3,理论等电点为5.87。不结球白菜Brc2-Cys Prx蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。该蛋白含有1个PRX_Typ2cys结构域,属于硫氧还蛋白超家族。系统进化分析表明:不结球白菜Brc2-Cys Prx蛋白与同属植物的进化关系相近,其中与大白菜和甘蓝型油菜进化关系最近。霜霉病菌侵染条件下,Brc2-Cys Prx基因表达呈逐渐上调趋势,在‘矮脚黄’中的表达与‘苏州青’相比上调迟钝,且该基因在‘矮脚黄’中的表达量一直低于‘苏州青’。0.2 mol·L^(-1)NaCl和200 g·L^(-1)PEG6000处理抑制Brc2-Cys Prx基因的表达;150μmol·L^(-1)CdCl_2处理促进Brc2-Cys Prx基因的表达,在24 h达到最大值;100μmol·L^(-1)ABA处理后,Brc2-Cys Prx基因表达上调,而12 h后,表达受抑制。[结论]霜霉病菌侵染条件下,Brc2-Cys Prx在抗性系‘苏州青’和感病系‘矮脚黄’中的表达存在差异,并且在抗病系中的表达量较高,推测Brc2-Cys Prx基因的高转录水平是抗病品种较之感病品种对霜霉病菌侵染具有更高抗性的原因之一。在非生物胁迫条件下,Brc2-Cys Prx基因具有不同的应答模式,推测可能是涉及到不同的物质或信号途径的原因。

肥城桃果实2-Cys Prx基因克隆、生物信息学分析及原核表达

为了深入研究2-Cys Prx基因调控桃果实氧化还原信号分子作用机制,结合了PCR技术和RT-PCR技术通过体外克隆的方法得到桃果实2-Cys Prx基因,通过对序列分析表明,2-Cys Prx基因全长1 424 bp,其中,编码区813 bp,共编码270个氨基酸。对其分子结构进行分析,2-Cys Prx蛋白分子量为29.7 ku,为疏水型蛋白,且是膜外蛋白。在线软件预测2-Cys Prx蛋白分子式为C1342H2110N348O403S4,分子量29.696 ku,由4 207个原子组成,理论等电点为6.23。使用Prot Scale分析该蛋白疏水性平均值为-0.126,说明2-Cys Prx为亲水性蛋白。TMHMM对跨膜结构进行预测,发现,2-Cys Prx氨基酸序列中不存在跨膜结构域,为膜外蛋白。此外,对该蛋白二级结构进行预测,发现2-Cys Prx有4个α螺旋结构、9个β折叠结构及无规则卷曲构成。系统进化树分析表明,肥城桃果实2-Cys Prx与其他植物氨基酸序列有较高同源性,其中与樱桃的亲缘关系最近,相似度达到了98.15%,表明植物体内2-Cys Prx具有较高的保守性。体外构建重组蛋白p ET-30a-2-Cys Prx成功在大肠杆菌BL21中表达,为下一步研究其功能与结构,从而探讨2-Cys Prx基因调控桃果实氧化还原信号作用机理奠定了基础。

转2–Cys Prx基因烟草F_1幼苗叶片光系统Ⅱ光化学活性对干旱胁迫的响应

以转2–Cys Prx基因烟草(龙江911)为材料,测定和分析了干旱胁迫下转基因烟草的光化学活性。结果表明:干旱胁迫下,转2–Cys Prx基因烟草叶片OJIP曲线上K点和J点的相对荧光强度增加量明显低于非转基因烟草,而2 ms时有活性反应中心的开放程度(Ψo)明显高于非转基因烟草;增强2–Cys Prx基因的相对表达,增加了干旱胁迫下烟草叶片PSⅡ电子供体侧OEC的电荷分离能力和受体侧QA向QB的电子传递能力;转2–Cys Prx基因烟草叶片在干旱胁迫下,吸收光能用于QA–以后的电子传递的能量比例(φEo)明显大于非转基因烟草,而非光化学猝灭的最大量子产额(φDo)。2–Cys Prx基因的表达可以提高烟草幼苗叶片的光化学活性,并改变光能的分配来增强其抗旱能力。

过表达和抑制表达2–Cys Prx基因烟草的生长特性和叶片光合功能

以过表达和抑制表达2–Cys Prx基因烟草(龙江911)为材料,测定和分析其生长特性和光化学活性。结果表明:过表达2–Cys Prx基因烟草的株高、根长、生物量显著高于非转基因烟草和抑制表达2–Cys Prx基因烟草;抑制表达2–Cys Prx基因烟草的PSⅡ反应中心电子传递速率(ETR)显著低于过表达2–Cys Prx基因烟草,过表达2–Cys Prx基因烟草的荧光曲线与Fm所围成的面积(Area)、2 ms时有活性反应中心的开放程度(Ψo)、吸收光能用于QA–以后电子传递的量子产额(φEo)、单位反应中心吸收光能用于电子传递的能量(ETo/RC)高于非转基因烟草,非光化学猝灭的最大量子产额(φDo)、单位反应中心耗散掉的能量(DIo/RC)低于非转基因烟草,而抑制表达转2–Cys Prx基因烟草呈现相反趋势。说明过表达2–Cys Prx基因烟草叶片吸收的光能更倾向于分配到光化学反应,以无效形式耗散的能量比例降低,这有利于为碳同化反应提供充足的同化力,以维持较高碳同化速率;抑制表达2–Cys Prx基因烟草叶片吸收的光能用于光化学反应的比例相对降低。