2-DE技术中疏水性和碱性蛋白质的研究进展

双向凝胶电泳(2-DE)具有高分辨率、高通量等特点,已被广泛地用于蛋白质组的分离.但是它在分离疏水性蛋白质和碱性蛋白质时却遇到了极大的挑战.然而,疏水性与碱性蛋白质在全蛋白质中占相当大的比例,且具有很重要的生物学意义.因而,近年来,越来越多的研究者将目标瞄准这些蛋白质,并且取得了一些令人鼓舞的进展:用亚细胞预分离技术,顺序提取法等方法来富集疏水性蛋白质,用一些新的有效的增溶剂如硫脲,ASB-14等来改善疏水性蛋白质的溶解,应用这些技术2-DE可分辨出总平均疏水值达0.80的蛋白质;在碱性蛋白质分离方面,通过等电聚焦预处理,使用窄pH梯度胶条等大大地改善了碱性蛋白质在2-DE中的分离,能分辨出等电点达11.7的蛋白质.现对2-DE技术中疏水性和碱性蛋白质分离的研究进展进行综述.

卵泡液蛋白质组学2-DE体系的构建与应用

卵泡液是在卵泡形成过程中生成的,作为卵母细胞生长和分化的培养基,直接或间接影响卵母细胞的生育力和发育潜能,其成分非常复杂。本研究通过调整,优化2-DE技术条件,建立了相对稳定的卵泡液蛋白质2-DE技术,获得了卵泡液蛋白质组表达图谱,并用PDQuest软件进行了图像分析,用MALDI-TOF MS鉴定了9个蛋白点,其中有四种为新鉴定的在卵泡液中表达的蛋白质。结果表明,该体系稳定性、重复性好,为进一步开展卵泡液蛋白质组学的相关研究奠定了基础。

乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc^2155细胞蛋白双向电泳图谱的差异分析

[目的]利用蛋白质组学方法,识别乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞后差异表达的蛋白质,为进一步探讨乙胺丁醇抑制分枝杆菌生长的作用机制及寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础。[方法]采用载体两性电解质pH梯度双向凝胶电泳技术分离乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞的总蛋白质,用PDQuest7.3.1图像分析软件比较分析,以识别差异表达的蛋白质。[结果]空白对照组有268个斑点,Ethambutol(EMB)处理组有蛋白斑点195个,在相对分子质量和pI值分布的任一区域,EMB处理组蛋白斑点数均少于空白对照组,其中在EMB处理组中特异表达的蛋白质斑点有23个。[结论]乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞的蛋白质组具有差异,这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究乙胺丁醇抑制分枝杆菌生长的作用机制并为寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础。

去甲斑蝥素处理肝癌细胞SMMC-7721蛋白质组的双向电泳分析

目的分析去甲斑蝥素(NCTD)作用于肝癌细胞SMMC-7721前后蛋白质组表达的差异。方法采用四氮唑蓝还原法(MTT)测定细胞生长抑制率。20μg/ml的NCTD作用于肝癌细胞SMMC-772124h,分别收集处理组与对照组细胞,裂解并提取细胞内总蛋白;双向凝胶电泳(2-DE)分离蛋白质,凝胶银染,ImageMaster2D Platinum软件分析2-DE图谱,寻找差异表达蛋白点。结果NCTD能诱导肝癌细胞SMMC-7721的凋亡,具有时间和剂量依赖性,与对照组比较,处理组2-DE图谱中有5个蛋白点表达上调,6个蛋白点表达下调。结论抗癌药NCTD能诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡并引起细胞内蛋白质组表达的改变。

非编码小RNA BSR0602在布鲁菌环境适应能力中的调控作用

BSR0602是位于布鲁菌染色体上的非编码小RNA,在前期研究中我们发现,BSR0602与布鲁菌的胞内生存能力相关.为了进一步研究BSR0602对布鲁菌胞内环境适应能力的调控作用,采用双向电泳技术对布鲁菌野生株16M和BSR0602过表达株的全菌蛋白质谱进行比较分析.结果显示,BSR0602过表达后,布鲁菌转运代谢蛋白和压力适应蛋白的表达发生变化.qRT-PCR和HIS表位标记实验结果进一步证实,BSR0602在转录和翻译水平均影响氧压力适应蛋白Sod A的表达.相关表型实验结果显示,BSR0602过表达株对氧压力更为敏感,证实了BSR0602在布鲁菌适应氧压力中的作用.结果表明,非编码小RNA BSR0602作为布鲁菌的转录后调控因子,可通过调控压力适应蛋白的表达来影响布鲁菌的压力适应能力和胞内生存.

蛋白质组学技术分析5-aza-2dC处理白血病细胞HL-60前后的差异表达蛋白质

目的:研究甲基化转移酶抑制剂5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycitydine,5-aza-2dC)对人急性髓系白血病细胞HL-60细胞蛋白质表达谱的影响,探讨5-aza-2dC抗急性髓系白血病作用的机制。方法:采用二维凝胶电泳(2-DE)技术分离5-aza-2-dC处理与未处理HL-60细胞的总蛋白质,PDquest图像分析软件识别差异蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质点。然后采用Western印迹检测差异蛋白质半乳糖凝集素1(Galectin-1)在药物处理与未处理HL-60细胞中的表达水平。结果:建立了5-aza-2dC处理与未处理HL-60细胞蛋白质的2-DE图谱,识别了35个差异表达的蛋白质点,鉴定了27个差异表达的蛋白质,其中包括Galectin-1在内的21个蛋白质在5-aza-2dC处理后的HL-60细胞中表达上调,6个蛋白质表达下调或缺失。Western印迹结果证实Galectin-1在5-aza-2dC处理HL-60细胞中表达上调。结论:21个表达上调蛋白质的编码基因可能是HL-60细胞的甲基化失活基因,它们可能与急性髓系白血病发病以及5-aza-2-dC抗人急性髓系白血病细胞作用有关。

STGC3基因表达上调对CNE2细胞系蛋白质表达谱的影响

目的 采用蛋白质组学方法,分析STGC3基因高表达对CNE2细胞系蛋白质表达谱的影响。方法 应用脂质体转染技术,将pcDNA3.1 ( + ) STGC3的表达质粒导入鼻咽癌细胞系CNE2 ,经G41 8筛选、RT -PCR技术鉴定阳性克隆,建立稳定高表达STGC3的细胞系;采用双向凝胶电泳分离CNE2、pcDNA3.1 ( + ) CNE2和pcDNA3.1 ( + ) STGC3 CNE2细胞的总蛋白质,图像扫描后用ImageMaster软件进行比较分析,识别差异表达的蛋白质点。结果 CNE2、pcDNA3.1 ( + ) CNE2和pcDNA3.1 ( + ) STGC3 CNE2细胞的蛋白质点分别为675±2 7、660±2 3和662±1 8个,蛋白质点主要分布在等电点为3.5～8.5、分子量为2 2～80kD的范围内。去除空白载体所致的蛋白质的差异后,在pcDNA3.1 ( + ) STGC3 CNE2细胞系中,确立了1 5个上调的蛋白质点和8个下调的蛋白质点。结论 STGC3基因高表达能引起鼻咽癌细胞系CNE2的蛋白质表达谱改变,此结果为进一步研究STGC3基因的抑瘤分子机制提供了很好的实验资料。

穿心莲内酯衍生物抗H2O2诱导胰岛RIN-mβ细胞凋亡的蛋白组学研究

采用蛋白组学方法筛选穿心莲内酯衍生物（AL-1）抗过氧化氢诱导胰岛RIN—mβ细胞凋亡的差异蛋白质分子并探讨其作用分子机制。结果显示：AL-1浓度依赖性地提高H2O2处理的胰RIN-mβ细胞的存活率。经蛋白组学研究分析，成功地鉴定了18个与凋亡、应激等相关的蛋白，包括Prohibitin、Shmt2、RhoGDP-dissociation inhibitor-1、Galectin-1、Cytb5、Hsps等；与对照组（H202）相比，处理组（AL-1＋H2O2）中，有9个表达上调的蛋白和9个表达下调的蛋白。AL-1过调控与细胞凋亡、应激等相关的蛋白发挥其抗H2O2诱导的凋亡作用。

大豆种子萌发过程中的差异蛋白质组研究

运用蛋白质组学技术对大豆(Glycinemax)N2899种子萌发0h、8h、36h、60h4个时期蛋白质的差异表达情况进行了研究.结果发现,在考马斯亮蓝染色的双向电泳pH3～10胶上,PDQuest图像分析软件可识别的点约350个,其中表达量变化2.5倍以上的蛋白质点有24个,而绝大部分大豆种子贮藏蛋白在萌发期尚未降解.在萌发的第一阶段,24个差异表达蛋白中有10个蛋白质的丰度发生变化.第二阶段,差异表达蛋白的种类和量增加,其中15个蛋白质是动态变化的,14个蛋白质在胚根突破种皮时表达量达到峰值,表明吸胀后种子内的生命活动越来越强.对这24个蛋白质点进行胶内酶解,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定均获得肽质量指纹图谱.搜索大豆的UniGene库初步鉴定出6个蛋白质,分别是核苷二磷酸激酶、热激蛋白、硫氧还蛋白、35ku种子成熟蛋白及种子成熟蛋白PM36.对这些蛋白质在种子萌发过程中可能的作用进行了讨论.

低温胁迫下棉花子叶蛋白质差异表达的双向电泳分析

采用TCA-丙酮沉淀法,改良优化了棉花蛋白质组研究中的双向电泳技术.通过对根和子叶全细胞蛋白的提取、蛋白的溶解、胶条的选择及电泳等环节的优化,得到了重复性很高、分辨率很好的蛋白质图谱.进一步对5 d苗龄的棉花进行4℃低温处理12 h后,提取子叶的蛋白质,利用双向电泳技术分离全细胞蛋白.并用PDQuest软件分析比较棉花子叶在低温处理下的蛋白表达谱,得到了49个有显著差异的蛋白点.其中,低温处理上调表达的蛋白点有27个,减弱表达的蛋白点有22个,推测这些差异蛋白点可能与低温胁迫相关.

缺铁逆境胁迫下水稻叶蛋白质组的双向电泳分析

水稻幼苗经缺铁胁迫诱导处理 1、3、5d后 ,用酚法和TCA 丙酮法提取叶的可溶性蛋白 ,进行双向电泳 (2 DE)分析 .结果显示 :(1 )三种缺铁胁迫的可溶性蛋白 ,在不同的pH范围中 2 DE图谱上的比较 .使用pH3～ 1 0宽范围、线性 (L)的IPG胶条 ,经电泳分离后利用Z3图象分析软件 ,可在SDS PAGE凝胶上检测到 4 5 0个左右的蛋白点 ,酸性蛋白占 89% .选用pH4～ 7窄范围、线性 (L)的IPG胶条 ,经电泳后可在SDS PAGE凝胶上检测到 6 0 0个左右的蛋白点 ,其中缺铁诱导上调表达的有 2 9个点 ,减弱表达的有 1个点 ,诱导特异表达的有 5个点 .(2 )不同方法提取可溶性蛋白的差异 .酚法提取的蛋白再溶性好 ,纯度较高 .TCA 丙酮法简单易操作 ,蛋白损耗少 ,在 2 DE图象上 ,碱性端显示的蛋白点较多 ,但此法的缺点是再溶性差 ,对 2

猫爪草提取物对临床分离结核分枝杆菌蛋白质组表达的影响

猫爪草已经临床治疗耐药结核病,但其作用机理和有效成分尚不清楚。为研究其可能的作用靶标,采用双向电泳技术比较分析猫爪草提取物作用前后结核分枝杆菌临床分离株的全细胞蛋白表达差异。发现22个蛋白质斑点具有明显差异,对其中3个表达明显下调的蛋白质斑点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析,获得了肽质量指纹图谱。数据库检索分析确定这3个点代表的蛋白质分别为硫代硫酸硫转移酶,延长因子Ts和热休克蛋白X,分别参与厌氧硫代谢、蛋白质翻译和蛋白质折叠分泌、转录调控等过程。这有助于深入研究猫爪草对结核分枝杆菌的作用机理,也为发现新的抗结核病治疗药物靶标提供了线索。

血清蛋白组学技术筛选寻常性银屑病相关蛋白的初步研究

目的初步探讨应用血清蛋白组学技术建立寻常性银屑病相关蛋白的优化筛选方法,筛选寻常性银屑病的相关蛋白,期望从中发现有意义的寻常性银屑病血清标志物。方法取寻常性银屑病患者及正常对照血清,应用ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit纯化血清蛋白,去除白蛋白和IgG,采用固相pH梯度(IPG)、等电聚焦(IEF)为第一向、SDS-PAGE垂自电泳为第二向的双向凝胶电泳(2-DE)和质谱分析鉴定差异蛋白。结果获得重复性和分辨率较好的血清双向凝胶电泳图谱,鉴定得到3个仅在银屑病组血清中表达和9个与对照组血清表达有差异的蛋白质。结论在寻常性银屑病患者血清与健康人血清中存在差异表达蛋白质,利用蛋白质组学这一高通量的筛查技术可望从中发现与寻常性银屑病相关的标志物。

低温选择大黄鱼(Pseudosciaena crocea)的肝脏蛋白质组双向电泳分析

采用双向电泳技术,对低温选择组与对照组大黄鱼进行肝脏蛋白质组双向电泳分析。结果表明,低温选择组肝脏蛋白点1673±47个,对照组1651±43个,共有19个蛋白点经低温选择后,表达量显著变化。从中挑选3个差异蛋白点进行肽指纹图谱(MALDI-TOF-MS)或串联质谱(LC-MS-MS)分析,然后MS-BLAST数据库搜寻。低温选择组大黄鱼肝脏MHC和CFL2蛋白表达显著上调,而2-CysPrxs蛋白表达显著下调。说明低温选育组大黄鱼机体抗细胞凋亡能力明显增强,预示低温选择后留下的大黄鱼在低温环境中生存能力更强。

成年无精子症男性睾丸活检组织双向电泳分析技术的初步建立及其优化

目的:建立并优化成年无精子症男性睾丸活检组织双向凝胶电泳图谱。方法:采用固相pH梯度等电聚焦为第一向,SDS-PAGE垂直电泳为第二向的双向电泳分离技术进行分离,凝胶经银染显色后,用Melanie 4软件分析双向凝胶电泳技术(2-DE)图谱。对聚焦参数的设置和样品的处理等步骤进行优化。结果:优化后成功地获得了成年无精子症男性睾丸活检组织分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。结论:应用2-DE初步建立了成年无精子症男性睾丸活检组织分辨率较高且重复性好双向凝胶电泳图谱,为从睾丸蛋白质组学水平进一步研究无精子症奠定了基础。

桂皮醛对发热大鼠下丘脑蛋白质组双向凝胶电泳分析

目的 :观察桂皮醛对酵母致热大鼠的解热作用及其对下丘脑蛋白质组的影响。方法 :采用双向凝胶电泳技术和计算机辅助图像分析方法 ,对蛋白质进行分离 ,以模型组作为参考胶进行匹配。结果 :口服给予桂皮醛后对发热大鼠有解热作用 ,双向电泳图像分析显示桂皮醛组与模型组匹配率为 86% ,多个蛋白质点表达量有不同程度的改变。结论 :桂皮醛对酵母致热大鼠有解热作用 ,其差异表达的蛋白质点可能参与了解热过程。

人肝癌细胞株QGY-7701蛋白质组学研究技术及二维电泳图谱的建立

目的:建立人肝癌细胞株QGY-7701蛋白质组学研究技术。方法:利用两种不同的裂解液提取细胞蛋白,进行双向电泳,经PDQuest软件分析与比较后,挑选匹配良好的10个蛋白点,进行基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的鉴定。结果:建立了稳定的人肝癌细胞株QGY-7701的双向电泳图谱,裂解液Ⅱ比裂解液Ⅰ提取的蛋白质量多25%,2-DE胶上蛋白点数多32%,从10个候选蛋向中鉴定出9个有意义的蛋白(P<0.05)。结论:初步建立了人肝癌细胞株QGY-7701的蛋白质组学研究技术,为进一步开展药物蛋白质组学研究奠定基础。

白鲢鱼肌原纤维蛋白双向电泳分析体系的建立

以白鲢鱼为研究对象,建立并优化其肌原纤维蛋白的双向电泳技术。结果表明,选用固相p H值梯度预制胶条p H 4~7,上样量120μg,等电聚焦程序Ⅲ(50 V主动水化15 h,250 V、2 h,1 000 V、2.5 h及4 000 V、3 h三段式除盐,8 000 V、2 h和10 000 V、1.5 h两段式升压,10 000 V聚焦80 000 V·h,500 V保持10 h)以及12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶条件下进行双向电泳,凝胶银染后用PDQuest软件分析,得到具有高分离度的肌原纤维蛋白双向电泳图谱,蛋白点清晰。

血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立

目的:建立血清蛋白质组双向凝胶电泳(2-DE)技术。方法:对血清蛋白质2-DE的各种条件进行调整、优化。结果:建立了稳定的2-DE技术。结论:已建立的血清蛋白质2-DE技术,将为进一步开展疾病的血清蛋白质组学研究奠定基础。

桃叶片总蛋白双向电泳技术的研究

采用改进的O'Farrell双向电泳系统,研究适于桃树叶片蛋白质组分析的双向电泳方法。通过对不同蛋白样品提取方法、不同pH梯度范围、不同上样量的比较,探索出一套适合桃树叶片总蛋白分析的双向电泳方法,即以TCA/丙酮沉淀法提取叶片蛋白质样品,采用两性电解质配比pH3～10︰pH5～7为1∶4的IEF胶条,按90μg蛋白上样量,并结合适宜的双向电泳参数,可获得背景清晰、重复性较好、蛋白分辨率高的双向电泳图谱。经此方法分离的桃叶片蛋白质经串联质谱分析(MS/MS)得到了较好的鉴定。