苏云金芽孢杆菌伴孢晶体中20-kb DNAs上染色体基因的鉴定

已有的研究表明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4.0718菌株菱形晶体中含有与原毒素紧密结合的20-kb DNAs,利用PCR-RFLP分析发现在这些20-kb DNAs上含有cry1Aa、cry1Ac、cry2Aa和cry2Ab基因.本研究利用特异引物从4.0718菌株中20-kb DNAs上分别扩增出带有自身调控序列的cry1Ac和cry2Aa基因,并将其分别电转至Bt无晶体菌株Cry-B中获得重组菌株Cry-B(pHC42)和Cry-B(pHC39).SDS-PAGE和透射电镜分析表明这两种重组菌株能够分别产生由130-kDa的Cry1Ac原毒素形成的菱形晶体以及由65-kDa的Cry2Aa原毒素形成的方形晶体.毒力生测的结果显示,这两种菌株的表达产物对棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫具有预期的杀虫效果.重组菌株分别形成的两种晶体经不同的缓冲液溶解后能释放出与20-kb DNAs紧密结合的原毒素,同时在20-kb DNAs上均可检测到源于Bt染色体的spo0A和nprA基因片段.

RNF20对紫外线诱导的胃癌细胞DNA损伤修复的影响

目的探究在紫外线暴露下环指蛋白20(ring finger protein 20,RNF20)低表达对胃癌细胞DNA损伤修复的影响及其相关作用机制。方法实验采用慢病毒载体构建稳定低表达胃癌细胞系,分为对照组和RNF20敲低组,用CCK-8法检测两组细胞的增殖情况,用总共照射剂量为20 J/m^(2)紫外线照射胃癌MGC803细胞,采用Western blotting及免疫荧光技术检测两组细胞γ-H2AX、RAD51和p21的情况。结果荧光显微镜观察两组细胞均有绿色荧光蛋白表达;CCK-8显示RNF20表达降低会促进胃癌细胞增殖;敲低组细胞中RNF20蛋白较对照组表达降低。与对照组相比,经20 J/m^(2)紫外线照射细胞后,敲低组γ-H2AX消失更加迟缓,RAD51蛋白表达降低,p21蛋白表达下降趋势更慢。结论RNF20敲低会抑制紫外线诱导的胃癌细胞DNA损伤修复过程。

甲基化转移酶抑制剂SGI-1027对肺腺癌细胞迁移侵袭抑制及SPG20基因甲基化调节作用观察

目的分析甲基化转移酶抑制剂SGI-1027对肺腺癌A549细胞迁移、侵袭能力的抑制作用及痉挛性截瘫-20(SPG20)基因甲基化水平的调节作用,以探讨甲基化转移酶抑制剂对肺腺癌细胞迁移、侵袭的影响及机制。方法以不同浓度甲基化转移酶抑制剂SGI-1027作用于肺腺癌A549细胞,MTT法测算细胞增殖活力,筛选得到SGI-1027最佳作用浓度为7.5μmol/L,作为后续实验的作用浓度。将A549细胞分为SGI-1027组和二甲基亚砜(DMSO)组,SGI-1027组培养基中加入SGI-1027培养,对照组培养基中加入DMSO培养。两组培养48 h时,采用划痕愈合实验观察细胞迁移能力,Transwell小室实验观察细胞侵袭能力;采用qRT-PCR法检测细胞DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)、SPG20 mRNA,焦磷酸测序法检测细胞SPG20基因甲基化水平,Western blotting法检测细胞DNMT3b、SPG20蛋白。结果培养48 h时,与DMSO组比较,SGI-1027组细胞迁移距离小、穿膜细胞数少(P均<0.05)。与DMSO组比较,SGI-1027组DNMT3b mRNA及蛋白相对表达量下降,SPG20 mRNA及蛋白相对表达量升高(P均<0.05)。SGI-1027组SPG20基因甲基化率较DMSO组降低(P<0.05)。结论甲基化转移酶抑制剂SGI-1027可抑制肺腺癌A549细胞迁移、侵袭能力,降低细胞SPG20基因甲基化水平;SGI-1027可能通过下调细胞内SPG20基因甲基化水平进而抑制肺腺癌细胞的迁移、侵袭能力。

脂质体介导基因转染人精子膜蛋白PH20 DNA疫苗质粒向小鼠骨骼肌导入

目的：精子膜蛋白PH-20分布在精子表面，在受精过程中起重要作用，可作为免疫避孕候选疫苗。采用脂质体介导基因转染法将pcDNA3．1（＋）-hPH20DNA疫苗质粒导入小鼠骨骼肌中，检测目的基因hPH-20在体内的表达水平。方法：实验于2006-06／2007-02在郑州大学解剖学实验室完成。①清洁级健康BALB／C小鼠12只，随机数字表法分为重组质粒组、空载体组、生理盐水组，4只，组，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。已构建好的pcDNA3．1（＋）-hPH20重组质粒由本室保存。②实验方法：质粒提取后，用精胺盐酸去除内毒素，鲎试剂检测呈阳性代表去除成功。取少量质粒行琼脂糖电泳鉴定纯度，用紫外分光光度计测量质粒DNA的含量。每只小鼠于股四头肌分点注射利多卡因预处理3d。重组质粒组将脂质体包裹的pcDNA3．1（＋）-hPH20DNA缓慢注射于股四头肌内，200μg／只。空载体组单纯将pcDNA3．1（＋）缓慢注射到股四头肌内，200μg／只。生理盐水组于相同部位缓慢注射等量生理盐水。重组质粒组分别于注射后第4，7，11，16天以断颈法各处死1只小鼠，空载体组、生理盐水组小鼠均于注射后第11天同法处死，迅速取股内侧肌肉30mg，研磨成粉末状，RT-PCR法检测目的基因hPH-20 mRNA在体内的表达。结果：①提取质粒琼脂糖凝胶电泳检测结果：提取的质粒成功去除内毒素后。琼脂糖凝胶电泳显示质粒纯度较高，绝大部分处于超螺旋状态，有利于体内转基因的表达。紫外分光光度计测量质粒DNA的含量（A260／A280）为1．8—2．0。②目的基因hPH-20 mRNA体内表达RT-PCR检测：重组质粒组注射后第4天即可检测到1530bp特异性条带，第7天表达增强，第11天达到高峰，第16天表达下降。空载体组、生理盐水组各时间点均未见特异性条带。结论：脂质体介导基因转染法能够高效将pcDNA3．1（＋）-hPH20DNA疫苗质粒导入小鼠骨骼肌中，且hPH-20基因于注射后11d呈峰值表达。

苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20kb DNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究

已经证实苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)伴孢晶体结合 2 0kbDNA ,但其序列特异性及作用有待进一步研究阐明。研究了选择性溶解Bt 4 0 718菌株Cry1类原毒素所形成的菱形伴孢晶体 ,从中抽提出与其结合的 2 0kbDNA。经NdeⅠ酶切消化后亚克隆构建文库 ,通过PCR RFLP及测序筛选出含cry1Ac基因的转化子。然后设计引物PCR扩增出cry1Ac基因的ORF并与pET30a连接 ,转化E .coliBL2 1(DE3) ,高效表达了 14 1kD蛋白。表达蛋白占总蛋白量的 5 0 %以上 ,且 90 %以上以包涵体形式存在。利用穿梭载体pHT30 4构建表达质粒pHTX4 2 ,电转化Bt无晶体突变株XBU0 0 1,获得重组菌株HTX4 2 ,经SDS PAGE分析 ,cry1Ac基因得到强表达 ,蛋白质定量分析显示目的蛋白量占总蛋白量的 79 2 8% ,且其在细胞中累积达细胞干重的 6 4 13% ,比文献报道的 2 5 %左右高了 1倍以上。原子力显微镜 (AtomicForceMicroscopy ,AFM)检测显示 ,目的基因在大肠杆菌 (E .coli)中表达的包涵体呈不规则形状且较小 ,而在无晶体突变株中表达的晶体呈典型菱形晶体 ,大小约为 1 2 μm× 2 0 μm。生测结果显示 ,包涵体与晶体对小菜蛾 (Plutellaxylostella)幼虫均有高效杀虫活性。本研究为构建高效杀虫工程菌及进一步阐明Bt伴孢晶体中 2 0kbDNA分?

《自然》2021年2月17日 科学家成功提取百万年前猛犸象的DNA

瑞典斯德哥尔摩大学等单位的研究人员从20世纪70年代在西伯利亚永久冻土层中发现的三个猛犸象象牙中成功提取了DNA,分别距今165万年、130万年和60万年。这项研究发表在2021年2月17日出版的《自然》杂志上。

二十岁以下慢性HBV感染者HBV DNA与HBeAg的定量关系

目的:探讨20岁以下慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者血清中HBV DNA、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)定量之间关系．方法:用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)及时间分辩荧光免疫分析(TRFIA)技术检测339例(1-20岁)慢性HBV感染者血清中HBV DNA、HBeAg含量,用速率法检测ALT水平．结果:HBeAg定量>0．3 NCU／mL、HBV DNA定量>105copies／mL、而ALT水平正常者占总检测病例的92．3％:HBV DNA定量(对数值)与HBeAg定量之间存在正相关关系(r=0．769,P <0．001)和线性回归关系(b=0．32,R2=0．59,P <0．001)．结论:20岁以下慢性HBV感染者血清中HBV DNA水平与HBeAg水平存在同时消长的关系,但是有极少患者例外．HBV DNA定量与HBeAg定量两种检测方法相结合应能够更客观地反映患者HBV感染状况,二者具有互补性．

分子标记中植物DNA提取方法的研究进展

自20世纪80年代初,分子生物学大量运用于植物研究领域后,DNA分子标记不仅在农业上对植物选种、育种和改良等方面的应用稳步增长,而且在中药资源、鉴定、栽培等方面也有着很好的发展前景.在一般情况下,DNA分子标记技术涉及的分子生物学原理比较简单,实验方法也不复杂,但熟练掌握、灵活运用,并有效地解决实验中出现的各种情况,仍有许多问题值得重视.其中,如何有效地提取高质量的植物DNA已成为生物化学研究的一个重要方面.DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作,如不能有效地完成DNA提取,那就无法进行分子生物学方面的实验.植物DNA的有效提取,根据不同研究需要,应保证结构的相应完整性;应尽量排除其他大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等);应保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子,尽可能少地降解.提取DNA的质量一般采用核酸蛋白质分析仪检测.植物DNA的有效提取,它是进行任何DNA工作的前提和基础,也是最关键的一步.

MST1启动子区DNA低甲基化在ApoE^(-/-)小鼠肾损伤中的作用

目的探讨哺乳动物不育系20样激酶1(MST1)及其DNA甲基化在载脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-)小鼠肾损伤中的作用及意义。方法实验动物分为2组:(1)Apo E-/-组(n=10):雄性Apo E-/-鼠饲以高蛋氨酸饮食;(2)对照组(n=10):雄性C57BL/6J鼠饲以高蛋氨酸饮食。喂养14周后,全自动生物化学分析仪测定小鼠血清肌酐和尿素氮水平;PAS染色及透射电子显微镜观察小鼠肾脏组织损伤情况;实时定量PCR及Western blot分别检测小鼠肾脏中MST1 mRNA和蛋白表达水平。巢式甲基化特异性PCR(n MS-PCR)检测小鼠肾脏MST1 DNA甲基化水平。结果与对照组比较,Apo E-/-组血清肌酐和尿素氮分别升高了1.1倍和1.6倍(P<0.01);PAS染色和透射电镜结果显示,Apo E-/-组较对照组肾脏明显损伤;Apo E-/-小鼠肾脏MST1表达分别与血清肌酐和尿素氮水平呈正相关(R2=0.7571,P=0.0012;R2=0.7342,P=0.0015);n MS-PCR结果显示,Apo E-/-组肾脏中MST1 DNA甲基化水平较对照组显著降低(P<0.01)。结论 MST1表达上调可能在Apo E-/-小鼠肾损伤中发挥重要作用,而MST1启动子区DNA低甲基化改变可能是MST1表达上调的重要机制。

A20基因甲基化对弥漫性大B细胞性淋巴瘤的影响

目的检测弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)中A20基因甲基化状况,探讨其对DLBCL临床过程及预后的影响。方法通过组织学观察及免疫表型检测筛选104例DLBCL,收集其临床病理资料及随访;并以甲基化特异性PCR(MSP)法检测A20基因启动子区5'Cp G岛甲基化的情况;以免疫组化SP法检测肿瘤细胞P糖蛋白(Pg P)和Ki-67蛋白的表达。结果 104例DLBCL中,A20基因甲基化率为26%(27/104),活化后B细胞样(ABC)-DLBCL组甲基化率(35.4%)高于生发中心B细胞样(GCB)DLBCL组(10.2%)(P<0.05);Pg P阳性率65.4%(68/104),A20基因甲基化组Pg P阳性率(85.2%)明显高于无甲基化组(58.4%)(P<0.05);A20基因甲基化与非甲基化组之间Ki-67高表达病例与低表达病例均无明显差异(P>0.05);A20基因甲基化病例的复发率明显高于无甲基化病例(P<0.05);生存分析发现,两组病例的生存状况差异不显著。结论 DLBCL部分病例存在A20基因甲基化,以ABC-DBLCL病例多见。A20基因甲基化与DLBCL的复发有关,且可能通过NF-κB异常活化而促进肿瘤细胞Pg P蛋白表达,从而影响DLBCL的化疗效果。

CCL20对HBV基因疫苗的免疫增强作用

CCL20为CC家族的趋化因子,对未成熟DC和T细胞具有较强的正向趋化作用。HBsAg是乙肝病毒中具有保护作用的结构抗原。以HBsAg为目的抗原进行基因免疫可诱导HBV特异性免疫应答。为进一步增强基因疫苗的免疫效果,研究中,应用基因重组技术,构建CCL20和HBsAg的真核表达载体,将重组体用肌肉注射方式免疫C57BL/6小鼠,通过ELISA方法检测C57BL/6小鼠的抗-HBs抗体水平、淋巴细胞增殖试验检测抗原特异性Th活性、FACS检测CTL效应。结果显示,用CCL20/HBsAg真核表达质粒共注射免疫后,100%小鼠能在第4、6周检测到抗-HBs抗体,CCL20可显著增强HBsAg基因疫苗诱导的体液免疫应答;Th活性和CTL效应检测也显示,CCL20增强了HBsAg诱导的特异性细胞免疫反应。这将为新型乙肝疫苗的分子设计和研制提供新的理论与实践依据。

20(S)-原人参二醇对人前列腺癌细胞凋亡的诱导作用

目的:研究20(S)-原人参二醇对人前列腺癌细胞凋亡的影响。方法:采用台盼蓝染色、噻唑蓝(MTT)法、Hochest33258染色和DNA Ladder方法分别测定20(S)-原人参二醇对DU145和PC3细胞凋亡诱导作用。结果:20(S)-原人参二醇可明显降低DU145和PC3细胞存活率和细胞活性,IC50分别为38.0μmol/L和28.6μmol/L。20(S)-原人参二醇处理后DU145和PC3细胞核出现典型的凋亡形态学改变,琼脂糖电泳呈现明显的DNA Ladder条带。结论:20(S)-原人参二醇可有效诱导人前列腺癌DU145和PC3细胞的凋亡并有剂量依赖关系。

幽门螺杆菌感染胃癌中CCL20核转录因子-κB表达的相互关系及临床意义

幽门螺杆菌（helicobacte pylori，HP）感染与胃癌的发生关系密切．是第一类致癌因素。但迄今为止其确切的致病和致癌机制尚不清楚。

幽门螺杆菌lpp20基因的克隆与表达

目的 克隆及表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)lpp20基因,为探索高效的防治幽门螺杆菌感染的疫苗抗原和诊断抗原奠定基础。方法 用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上扩增出1pp20基因片段,将目的基因插入的表达载体pMAL-C2X中,用重组质粒转化大肠杆菌(E.coli TBI),并在E.coli TB1中进行表达。用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析。结果 用PCR方法扩增的lpp20基因长度约为540 bp;经酶切、PCR和测序分析,插入到载体的基因片段与文献报道的基因序列一致;SDS-PAGE的结果显示,目的基因表达产物的相对分子质量为18kDa,融合蛋白的表达量占全菌总蛋白的34%。结论 本研究中构建的pMAL-C2X与lpp20基因重组质粒在E.coli TB1中能够高效表达目的基因。该重组子的构建为幽门螺杆菌lpp20基因的研究建立了重要的基础。

DNA分子标记及其在谷子遗传育种中的应用

分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记技术。分子标记技术自20世纪80年代产生以来,在水稻、玉米和小麦等作物上已得到广泛应用。自1997年以来,分子标记在谷子方面的研究也取得了明显进展。笔者在介绍分子标记的类型及特点基础之上,对其在谷子上的研究情况进行了综述,并对将来的发展方向做了分析和展望。