5-aza-dC对293A细胞增殖的影响

目的观察5-氮-2'脱氧胞苷(5-aza-2'deoxycytidine,5-aza-dC)对293A细胞增殖的影响,初步探讨其在治疗肾脏肿瘤的作用及可能机制。方法实验组以1.0μmol/L的5-aza-dC处理人胚肾癌293A细胞,对照组加等体积的磷酸缓冲液(PBS),用MTT法测定实验组和对照组1～4 d的光密度值,通过比较实验组和对照组的第4天吸光度值来计算抑制率,流式细胞仪检测5-aza-dC对293A细胞株细胞周期的影响,实时定量PCR检测相关基因DNA甲基转移酶(DNMT)1、3A和3B mRNA的表达。结果 MTT检测实验组和对照组第4天的光密度分别为0.0663±0.0034和0.5453±0.0311,5-aza-dC能抑制人胚肾癌293A细胞的增殖;实验组与对照组相比,实验组91%细胞被阻滞在S期,5-aza-dC处理细胞后使细胞周期发生变化;实验组DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA相对于beta-actin mRNA的丰度值分别是0.036810892±0.007,0.008603032±0.001和0.023717786±0.005,而对照组相对丰度值是0.05594012±0.009,0.0362811±0.011和0.8751847±0.092;5-aza-dC处理使DNMT1、DN-MT3A和DNMT3B mRNA表达降低(P<0.05)。结论 5-aza-dC能抑制293A细胞株的增殖,其作用可能是通过降低DNMTs表达来干扰正常的细胞周期实现的。

6种人DNA甲基转移酶3B典型异构体的克隆、表达及对293A细胞增殖的影响

目的构建6种人DNA甲基转移酶(DNMT)3B典型的异构体的真核表达载体并对其进行过表达,初步探讨其在人胚肾细胞系293A中的生物学作用。方法以人HCT116 c DNA为模板,采用高保真PCR获得DNMT3B1和DNMT3B2的全长,并以DNMT3B2为模板,利用特异的引物扩增出DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5和DNMT3B7,将PCR产物连接到真核表达载体p CMV-2B上,并对上述载体进行Bam HⅠ、EcoRⅠ双酶切和测序鉴定,鉴定正确后,将重组质粒转染293A细胞并利用G418筛选出稳定表达的克隆株,MTT法检测细胞增殖活力。结果双酶切和测序结果表明克隆了6种人DNMT3B异构体CDS序列,经蛋白印迹检测,DNMT3B异构体在293A细胞中获得稳定表达;稳定过表达DNMT3B3、DNMT3B4和DNMT3B7可以抑制细胞增殖。结论构建了人DNMT3B异构体真核表达载体及获得了其稳定表达细胞株,DNMT3B异构体蛋白对胚肾细胞系293A的增殖有不同的作用。

血管紧张素Ⅱ2型受体重组腺病毒的扩增及其在INS-1细胞中的转染

目的利用人胚肾(HEK)293A细胞株扩增含有大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因的重组腺病毒,并在大鼠胰岛素瘤细胞INS-1细胞株中进行转染,构建AT2R高表达的胰岛β细胞模型。方法利用293A细胞株扩增重组腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP和对照病毒Ad-CMV-EGFP,并测定病毒滴度。在INS-1细胞中瞬时转染后利用实时PCR、Western印迹以及免疫荧光和激光共聚焦技术检测细胞中AT2R与AT1R的表达。结果扩增后得到重组腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP和Ad-CMV-EGFP的滴度分别为9×109和8×109pfu/ml。在INS-1细胞中转染Ad-GAT2R-EGFP后,AT2R mRNA的表达随病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)值的增加呈剂量依赖性增加。当MOI值为10时,AT2R mRNA的表达达到峰值(P<0.05),同时AT2R蛋白的表达明显高于转染了Ad-CMV-EGFP的细胞和未转染细胞,但AT1R的表达无显著变化。结论成功扩增并得到高滴度且携带有AT2R基因的重组腺病毒载体,并将其转染入INS-1细胞中构建出AT2R高表达的胰岛β细胞模型,为下一步探讨AT2R在胰岛β细胞中的作用奠定了基础。