人源WNT16 HEK 293T稳转细胞株构建、蛋白纯化与活性检测方法研究

目的无翅型MMTV整合位点家族成员16(WNT16)是一种重要的信号调节蛋白,参与多种细胞生物学过程的调控。本研究旨在构建稳定转染WNT16基因的HEK 293T细胞株,并利用多聚赖氨酸标签(HIS-Tag)实现高效纯化WNT16蛋白。方法使用TK-PCDH-copGFP-T2A-Puro载体,将WNT16 CDS-HIS序列通过XbaI和BamHI位点连接载体,构建慢病毒载体质粒;将该质粒与pSPAX2和pMD2.G一起共转染HEK 293T细胞,制备携带WNT16基因的慢病毒;利用慢病毒感染HEK 293T细胞,并通过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定稳定过表达WNT16的细胞株;利用镍螯合琼脂糖凝胶与HIS标签的高亲和性纯化WNT16蛋白,使用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测纯化效果;用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞,使用Western Blot法检测Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,以评估WNT16蛋白的活性。结果成功构建过表达WNT16基因的慢病毒表达载体,并用其感染HEK 293T细胞。经过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定,我们获得了稳定表达WNT16的HEK 293T细胞株。使用HIS标签成功纯化了WNT16蛋白,并用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测了纯化效果。最后,我们用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞,并用Western Blot法检测了Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,WNT16蛋白能够显著增加Jurkat细胞中β-catenin蛋白的表达,表明纯化的WNT16蛋白具有激活WNT/β-catenin通路的生物学活性。结论本研究成功实现了WNT16蛋白的高效表达和纯化,并初步研究了其功能。这为进一步探究WNT16在细胞生物学中的作用提供了重要的实验基础。

过表达泛素偶联酶E2C对293T细胞增殖的影响

目的:构建稳定过表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C)的293T人胚肾细胞株,初步探讨其对293T细胞增殖的影响。方法:采用脂质体法将已成功构建的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒转入293T人胚肾细胞株中,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株;用Western blot技术检测并鉴定UBE2C基因在293T细胞中的表达情况;用MTT法检测UBE2C对293T细胞增殖的影响。结果:Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的UBE2C蛋白表达水平明显高于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。MTT法检测结果显示转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的增殖速度明显快于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。结论:成功建立稳定过表达UBE2C的293T细胞株,过表达UBE2C可促进293T细胞的增殖。

人LIGHT基因的克隆及其在293T细胞中的表达

目的 克隆人LIGHT分子的全长cDNA ,构建重组真核表达质粒pCI neo LIGHT并在 2 93T细胞上获得稳定表达。方法 从人T细胞cDNA文库中用PCR技术克隆人LIGHT全长cDNA ,装入T Easy载体 ,测序证实后 ,将LIGHTcDNA装入质粒pCI neo中构建真核表达载体。用电穿孔法转染 2 93T细胞 ,经G418筛选后 ,用流式细胞仪检测LIGHT分子的表达。结果 测序证实克隆的LIGHT全长cDNA阅读框正确完整 ,酶切证实LIGHT pCI neo中LIGHT插入方向正确。转染的2 93T细胞经G418筛选 3个月后 ,流式细胞仪检测有 78 69%的细胞表达人LIGHT分子。结论 成功克隆LIGHT基因并获得稳定表达膜型LIGHT分子的 2 93T细胞系。

稳定表达PDCoV-S和RBD蛋白的293T细胞系构建与免疫原性评价

为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S和RBD蛋白的293T细胞系,获得PDCoV S和RBD蛋白。本研究将优化合成的PDCoV S蛋白全长基因及其RBD的表达质粒进行双酶切鉴定,将重组质粒pLV-S-Puro、pLV-RBD-Puro、psPRX2、pMD2.G同时转染293T细胞中进行慢病毒包装,收集上清感染293T细胞,经嘌呤霉素初筛得到的多细胞克隆,进一步通过终点稀释法筛选获得稳定表达PDCoV S和RBD蛋白的单克隆293T细胞系,通过Western blot检测蛋白表达,用纯化的PDCoV S和RBD蛋白分别免疫BALB/c小鼠,对重组蛋白进行免疫原性检测。结果表明,稳定表达PDCoV S和RBD蛋白的293T细胞系构建成功,获得了重组慢病毒,纯化PDCoV S和RBD重组蛋白均可以诱导小鼠产生较高的IgG抗体(S:1.2;RBD:0.9),中和抗体水平分别达1∶128和1∶64。本研究构建的293T细胞系能稳定表达PDCoV S和RBD蛋白,为进一步研制PDCoV亚单位疫苗奠定了基础。

核不均一性核糖核蛋白H2(hnRNP H2)对单纯疱疹病毒(HSVⅠ)复制影响

本文研究了单纯疱疹病毒(HSVⅠ)在感染与复制过程中影响宿主细胞RNA转录,蛋白表达,进而为病毒的潜伏和持续感染创造必要条件.采用基于2-DE分析,人正常肝细胞L-02细胞核不均一性核糖核蛋白H2(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2,hnRNP H2)在感染HSVⅠ前后存在表达差异,构建pcDNA-hnRNP H2真核表达载体及hnRNP H2稳定转染的293T细胞系的方法,研究在核不均一性核糖核蛋白H2(hnRNP H2)稳定过表达后对HSVⅠ病毒复制周期的影响.结果表明,病毒滴度和生长曲线显示,hnRNP H2可以显著影响病毒复制周期.过表达hnRNP h2的细胞系与对照相比,其病毒滴度明显下降,hnRNP H2在HSVⅠ病毒复制中起到比较明显的抑制作用,其作用机理还有待进一步研究.

慢病毒包装体系的建立与体外表达

为筛选出最佳的慢病毒转染处理时间,研究三质粒对慢病毒包装的最佳浓度配比,以及对293T细胞的细胞转染率和滴度,通过脂质体与Fugw质粒混合后转染293T细胞,观察293T细胞的形态和荧光表达量。结果表明:转染6h组的细胞形态略好于8h;转染8h组和6h组的转染率均极显著高于10h组(p<0.01),但彼此间差异不显著(p>0.05);质粒配比为4:3:2时,慢病毒滴度最高,达3.795×107TU·m L-1,经离心后滴度与离心之前相比能提高100倍。不同浓度的质粒配比对293T细胞转染率和滴度方面,B组(4∶3∶2)的转染率最高、C组(3∶2∶1)最低、A组(5∶4∶3)介于二者之间,3组间彼此差异极显著(p<0.01);转染后B组的滴度极显著高于A组和C组(p<0.01),而A组和C组间差异不显著(p>0.05)。感染293T靶细胞存在EGFP基因表达。利用10μL脂质体2000介导4μg的Fugw质粒转染293T细胞的最佳时间为6h;当Fugw∶△8.2∶Vsvg为4∶3∶2时,慢病毒转染293T细胞的效果最好。

人肌细胞增强因子2C基因慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建人肌细胞增强因子2C(MEF2C)慢病毒表达载体并检测其表达性能,以便应用过表达技术进一步研究MEF2C的功能。方法以人MEF2C基因序列为模板合成其编码框序列,通过限制性内切酶NotⅠ和NsiⅠ酶切、T4DNA连接酶连接,将MEF2C插入慢病毒载体质粒LV5-GFP,构建人MEF2C基因重组慢病毒质粒载体,转化感受态细菌,筛选阳性克隆,与包装质粒通过脂质体共转染人胚肾细胞系293T,进行慢病毒包装并测定病毒滴度。病毒感染293T细胞,荧光显微镜下观察感染效率,PCR方法检测MEF2C mRNA的过表达情况。结果成功构建慢病毒表达载体LV5-MEF2C-GFP,三质粒共转染293T细胞后形成假慢病毒颗粒;浓缩假病毒后测定其滴度为2×109TU/ml;以复感染系数MOI为5感染293T细胞,感染效率在70%以上。PCR证实感染带有目的基因假病毒的293T细胞表达MEF2CmRNA的水平较感染阴性对照病毒的293T细胞表达水平明显升高(t=11.93,P=0.000)。结论成功构建MEF2C慢病毒表达系统,为应用过表达技术探索其在肿瘤发生和发展中的作用奠定了基础。

中国大鲵虹彩病毒对293T细胞系的感染性研究

中国大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV)属于虹彩病毒科蛙病毒属,对两栖类具有强致病率,给两栖类养殖业带来了严重的经济损失。本研究将人胚肾细胞系(293T)作为CGSIV的潜在宿主细胞系,通过验证26℃下CGSIV对293T细胞的感染性及病毒特性,为将293T发展成为CGSIV病毒研究的细胞系模型打下基础。利用PCR、Western Blot和透射电镜等技术对CGSIV感染293T细胞及其在293T细胞中的基因表达、病毒复制及子代病毒等进行验证;并通过半数组织培养感染剂量(Median tissue culture infectious dose,TCID50)法和绝对定量qPCR检测CGSIV在293T中的病毒滴度及病毒含量。结果表明:293T在接种CGSIV 72 h时出现了典型的病变特征;成功在受感染的293T细胞内检测到CGSIV基因组及病毒相关基因的转录和翻译,表明CGSIV能够成功感染293T细胞并在细胞内顺利完成病毒相关基因的表达;通过透射电镜观察到293T细胞内呈晶格状排列且横切面为正六边形的病毒粒子,病毒感染实验显示其病毒粒子能够感染鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC),表明CGSIV能够在293T细胞内顺利完成其生活周期,产生具感染力的完整子代病毒;CGSIV在293T细胞内的病毒滴度约为2.26×105TCID50/mL;CGSIV在293T细胞中的复制时序表明病毒在感染24 h内复制缓慢,36 h后进入复制高峰期并延续于整个感染周期内。综上,在26℃下,CGSIV能够感染293T细胞系,并在细胞内完成其生活周期,产生具有感染力的完整子代病毒;另外,CGSIV对293T细胞的感染与鱼类细胞相比,其感染病变时间也有所延长。本研究为发展293T细胞作为CGSIV病毒研究的细胞系新模型奠定了基础。

人HoxA10基因真核表达载体构建和表达产物的鉴定

目的:克隆人子宫内膜容受性标志分子HoxA10基因的cDNA,转入真核细胞载体,并在293T细胞中进行表达和鉴定。方法:应用RT-PCR法从人子宫内膜组织中扩增HoxA10基因的cDNA编码区序列,将PCR产物克隆至pCMV-HA真核表达载体中,测序鉴定该载体。以LipofectamineTM2000将该载体转染入293T细胞中,Western blotting检测HoxA10蛋白的表达。结果:PCR扩增出的人HoxA10基因cDNA正确克隆到了pCMV-HA载体,成功构建了pCMV-HA-HoxA10重组载体;将其转染入293T细胞,用HoxA10和HA抗体进行Western blotting,均检测到了融合蛋白的表达。结论:携带有HA蛋白标签的人HoxA10基因的真核表达载体pCMV-HA-HoxA10克隆及表达成功,为进一步研究HoxA10与其它蛋白质的相互作用以及建立HoxA10的荧光素酶报告基因分析系统奠定了基础。

携带人二氢叶酸还原酶基因慢病毒表达载体构建及鉴定

目的:构建携带人二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的慢病毒表达载体pWPI。方法:采用PCR方法扩增二氢叶酸还原酶cDNA全长,与EZ-T克隆载体连接,HindIII及BamHI-HF限制性内切酶双酶切回收的PCR片段并补平其缺口。慢病毒系统载体使用pWPI系统,采用PmeI酶切载体后回收片段,将其磷酸化,T4酶连接载体与目的基因。表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,重组质粒采用脂质体转染293T包装细胞后获得包装的病毒颗粒。结果:成功扩增二氢叶酸还原酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体DHFR-pWPI,重组质粒测序结果显与DHFR基因的同源性达100%,按标准生产程序转染293T后有DHFR基因的表达。结论:成功采用慢病毒载体系统构建了二氢叶酸还原酶重组慢病毒转基因,为探讨DHFR在肿瘤多药耐药过程中的分子机理奠定基础。