新疆盐生植物猪毛菜逆向运输蛋白基因SaNHX1 3’-RACE的克隆及序列分析

以新疆盐生植物猪毛菜(Salsola collina Pall.)为材料提取总RNA,根据NHX1家族同源序列保守区设计1对简并引物,进行RT-PCR扩增,得到猪毛菜逆向运输蛋白基因cDNA中间一段619 bp序列。再用快速扩增cDNA 3’末端(3’RACE)方法,得到约1 000 bp 3’末端序列。将两段序列进行拼接,得到猪毛菜长为1 585bp(Gen Bank登陆号为EU072932)的逆向运输蛋白基因(SaNHX1)cDNA序列,编码370个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与同科耐盐植物盐角草相应序列同源性为85%和87%,研究为进一步克隆猪毛菜NHX1全基因序列和研究其功能打下基础。

褐飞虱Nilaparvata lugens(S"非汉字符号"l)肌动蛋白基因3′-RACE及基因表达的RT-PCR检测

通过锚定的 3′ RACE筛选实验 ,确定锚定效率最好的下游引物 ,用于褐飞虱各发育期肌动蛋白基因表达的RT PCR检测。结果表明 :3个锚定引物中 ,0 4 2 2 7( 5′ >TCACACAGGAAACAGCTATGACTTTTTTTTTTTTTTA <3′)的锚定效率最好 ,可以扩增出 5条褐飞虱的肌动蛋白基因 3′末端片段 ,依其大小命名为BPH A、BPH B、BPH C、BPH D、BPH E。RT PCR检测表明 :BPH A从 3龄开始到成虫期都有常量表达 ;BPH B、BPH C、BPH E从 2龄开始到成虫期都有表达 ;BPH D在整个幼虫期都有表达 。

东北地区大豆种质资源对SCN3抗性表型评价

为明确东北地区种质资源对大豆胞囊线虫3号生理小种(SCN3)抗性,以东北地区常用作亲本的620份大豆品种(系)为材料,经2020-2021年SCN3号生理小种田间病圃及室内盆栽接种鉴定。结果表明,2020年田间病圃鉴定对SCN3号生理小种表现中抗以上品种(系)有30份,抗病种质仅占鉴定种质总数的4.84%,2021年对这30份中抗以上材料进行室内盆栽接种鉴定,除白农9号、嫩丰15外,其余品种(系)抗性级别鉴定与田间病圃结果一致。其中农庆豆24、农庆豆28、齐农5号、丰豆1号等13个中抗以上品种可在大豆胞囊线虫病发区直接应用,MN0902CN、MN1701CN、中品03-5373、中品03-5297等9份抗病品系可用作种质资源创新抗病亲本,其他8份中抗品系可用作拓宽抗性基因遗传基础的复合杂交亲本。

从LongSAGE标签获取cDNA长片段的3'-RACE方法的建立

长标签基因表达系列分析和末端快速扩增都是目前人类基因组研究中的重要方法.该文介绍了一种我们改良以后的末端快速扩增方法(3'-RACE),用于从LongSAGE标签扩增基因3'端序列.实验证明该方法技术稳定、重复性好,所获得的3'端cDNA纯度高、完整性好,表明该方法切实可行.

大豆胞囊线虫3号生理小种抗性相关TIFY基因生物信息学分析

TIFY转录因子参与调节植物的生长和发育,同时参与植物应激反应,在植物生长中具有重要调控功能。为探索TIFY基因家族成员在大豆胞囊线虫病(Soybean Cyst Nematode,SCN)3号生理小种抗性反应中的作用,选择抗病品种东农L-10和感病品种黑农37进行SCN 3号生理小种胁迫处理,在转录组测序数据中分析筛选到多个与抗性相关的TIFY转录因子,并对其进行生物信息学预测和分析。结果表明:从转录组数据中鉴定和筛选到23个与SCN 3号生理小种相关的差异表达TIFY转录因子,其中18个转录因子上调表达,5个转录因子下调表达,TIFY基因在大豆的根、茎、叶均存在一定表达量,在相同的大豆胞囊线虫胁迫下,抗病品种中TIFY表达量要高于感病品种。不同TIFY转录因子之间的理化性质存在较大差异。23个转录因子均属于亲水性蛋白,多数为酸性等电点。亚细胞定位预测结果显示,TIFY转录因子发挥重要作用的位置依次为细胞核、细胞质、线粒体。蛋白质二级结构中氨基酸序列以无规则卷曲为主要组成,α-螺旋次之,β-折叠和β-转角则散布于蛋白质序列中。基因分布在大豆的10条染色体上,磷酸化位点丝氨酸偏多,启动子中存在很多响应激素应答和胁迫相关的顺式作用元件,说明TIFY基因所编码的蛋白中部分为响应胁迫的蛋白。研究结果说明筛选到的23个与SCN 3号生理小种相关的TIFY转录因子可为进一步了解大豆TIFY基因的功能提供重要参考。

薏苡乙醇脱氢酶基因(ADH1)3’末端序列的克隆

采用3’-RACE技术,根据前一阶段已克隆的的薏苡(Coix lacrymajobi L.)乙醇脱氢酶基因(ADH1)cDNA片段(Accession DQ455071)设计特异性引物,克隆出556bp的乙醇脱氢酶3’末端cDNA序列,利用DNAMEN软件将获得序列与已知序列进行拼接,得到了1个1234bp的cDNA序列。

湖羊lncRNA-269的鉴定及转录调控分析

[目的]本文旨在研究湖羊长链非编码RNA-269(long no-coding RNA-269,lncRNA-269)序列特征、表达模式和转录调控,为后续开展lncRNA-269的功能研究提供理论基础。[方法]以湖羊为研究对象,采用5′/3′RACE结合PCR扩增方法获得其序列全长,利用RT-qPCR方法鉴定其在湖羊组织中的表达模式,并利用PCR方法扩增其启动子区,鉴定其启动子区特征,分析其转录调控情况。[结果]湖羊lncRNA-269全长3 146 bp,组织表达谱显示其在湖羊各组织中广泛表达,且在健康卵泡中显著高表达,其表达水平与NR5A1 mRNA水平和血清中雌二醇(E_(2))水平呈正相关。荧光素酶活性分析发现在lncRNA-269启动子区的-359~-17 nt有1个转录激活基序,在-1 485~-942 nt有1个转录抑制基序。JASPAR软件预测发现在lncRNA-269转录抑制启动子区域存在FOXO3、PDX1等转录因子结合位点,在转录激活区域有SMAD4、YY1等转录因子结合位点。过表达SMAD4可显著提升lncRNA-269启动子区荧光素酶活性,染色质免疫沉淀(ChIP)-PCR试验进一步确认了SMAD4特异性与lncRNA-269启动子区结合。[结论]湖羊lncRNA-269在健康卵泡中显著高表达,其启动子区存在一个转录激活区域和一个转录抑制区域,转录因子SMAD4可通过与lncRNA-269启动子区结合显著上调lncRNA-269的启动子活性。

鸭肝炎病毒基因组3′末端序列的克隆和分析

用3′RACE和RT-PCR扩增并克隆鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）Ⅰ型毒株C80和Ⅰ型变异株E63的3′末端序列。分析结果显示,C80株和E63株基因组3′末端均包含1 359 nt的3D、终止密码子TGA、长314nt的3′UTR,而poly（A）尾分别含18个A和19个A。由2株DHV 3D核苷酸序列所推导的3D蛋白均含453个氨基酸,均包含KDELR、DxxxxD、GxxCSGxxxTxxxNS、YGDD和FLKR等小RNA病毒RNA聚合酶的特征基序,该结果进一步证实Ⅰ型DHV属于小RNA病毒科的成员。两株DHV与小RNA病毒科9个已知属之间3D蛋白的氨基酸序列同源性为16%-37%,介于属间3D蛋白的氨基酸序列同源性范围（18%-60%）之内;此外,Ⅰ型DHV的3′UTR在小RNA病毒科是最长的。用3D蛋白进行进化分析的结果表明,Ⅰ型DHV可能属于小RNA病毒科的一个独立的病毒属。

沙棘耐盐基因HrNHX1的克隆及3'UTR序列分析

以沙棘(Hippophae rhamnoides L.)叶片为材料,用改良SDS法提取总RNA,反转录合成第一链cDNA作为模板,根据已公布NHX1家族同源序列保守区设计简并引物,扩增出沙棘中HrNHX1基因的中间序列,然后用快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA end,RACE)方法,从沙棘中克隆到HrNHX13'cDNA序列。该序列(GenBank登录号:EU718492)长度为1373bp,与已知NHX1序列同源性最大为80%,其编码区1094bp,编码364个氨基酸,3'非翻译区(3'-untranslated region,3'UTR)长度为239 bp。3'UTR序列分析显示沙棘的3'UTR与陆地棉、葡萄柚和小盐芥的同源性分别为43.97%、45.63%和40.64%,明显低于编码区的同源性。结果表明,NHX1基因编码区具有较高的保守性,3'UTR序列的同源性较低,显示了非编码区在环境适应中的重要性,并为进一步研究沙棘对生境的适应分子机制奠定了基础。

甜菜夜蛾泛素延伸蛋白基因cDNA的3′RACE-PCR扩增及其克隆和表达

根据已知的草地夜蛾Spodopterafrugiperda的泛素延伸基因 5′端核苷酸序列设计引物 ,应用 3′RACE PCR技术 ,从甜菜夜蛾S .exigua脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素基因的cDNA片段。扩增得到的片段全长 5 13bp ,3′末端有 12 3bp的非翻译区 ,翻译区编码一个长为 12 9个氨基酸残基的蛋白质 ,预测分子量为 14 8kD。同源分析表明 ,此cDNA序列为ubiquitin 5 3aaextensionprotein(ubi 5 3)基因 ,在泛素蛋白后融合了一个核糖体L4 0蛋白 (ribosomalL4 0protein)。用MagAlign和Genedoc软件对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析 ,结果表明 :甜菜夜蛾的ubi 5 3基因与真核生物家蚕Bombyxmori、草地夜蛾、果蝇Drosophilamelanogaster和人Homosapienes泛素的同源性分别为 96 9%、98 5 %、95 3%和 93 0 % ,与甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)泛素的同源性为 78 8% ,说明真核生物的泛素基因与核型多角体病毒的泛素基因可能存在不同的分子进化途径。将甜菜夜蛾的ubi 5 3基因克隆到原核表达载体pET 2 8a上 ,转化至BL2 1(DE3)中 ,用IPTG进行诱导表达 ,用异源泛素单克隆抗体进行Westernblot检测 。

Race法扩增4株鸭肝炎病毒3′末端序列及其克隆分析

利用3’RACE方法扩增并克隆了4株鸭肝炎病毒（DHV）（ZYM株、Z05株、Z07株和Z10株）的基因组的3’末端真实序列，包括部分非结构蛋白（3D）基因以及紧接着3D基因下游的3’端非编码区（untranslated region，UTR）和poly（A）尾巴。测序结果表明，扩增的特异性片段长度为597nt（不包括polyA尾巴）。各毒株3’UTR均为315nt，位于终止密码子TGA之后，比对分析结果表明各毒株间的同源性较高；4株DHV 3’末端核苷酸序列（不包括polyA尾巴）之间的同源性为96．3％～100％，而与参考毒株之间的同源性为93．5％～99．7％。在系统发生进化树上，各毒株亲缘关系较近。

燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ基因3′端cDNA的克隆及分析

实验利用3＇-RACE技术进行燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ（Oglc13Ⅱ）3＇末端cDNA的快速扩增并进行序列分析.将0.01%的HgCl2诱导处理24h之后的燕麦（Avena Sativa）幼叶作为材料,利用RT-PCR技术得到Oglc13Ⅱ的部分cDNA片段,根据此片 段设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即3＇sites Adaptor Primer作为下游引物,按3＇RACE试剂盒（Takara）操作流程进行Oglc13Ⅱ3＇末端cDN A的快速扩增,成功获取837bp的3＇-RACE反应产物,通过BLAST技术,发现该片段与 许多植物β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高的相似性（50.0%～72.0%）.因此认为成功 克隆了Oglc13ⅡcDNA的3＇末端序列.

富有柿果实ACC合成酶3′末端的cDNA克隆

利用3′RACE的方法对柿果实ACC合成酶基因的3′末端进行扩增,扩增产物克隆到pMD18-T Vector载体上,转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α,蓝白斑筛选重组质粒,并对插入片段进行序列测定。结果表明,3′RACE产物长912 bp,开放阅读框内核苷酸序列编码251个氨基酸,此氨基酸序列含有ACC合成酶中3个高度保守区,GenBank中登录的DK-ACS1(登录号AB073005)序列只有一个的氨基酸不同。终止子后面的3′非编码区的长度为155 bp,其中只有一个核苷酸与DK-ACS1的3′序列非编码区不同。序列分析结果显示,克隆的片段含有5′端GSP Inner Primer和3′端为RACE Inner Primer的引物。

猪嵴病毒441株3D基因的克隆及序列分析

根据GenBank中登录的猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)核苷酸序列设计引物,利用RT-PCR技术及3'RACE法扩增猪嵴病毒441株(swKoV CH441株)3D基因。成功扩增了swKoV CH441株的3D基因,3'非编码区(3'untranslated region,3'UTR)及Poly(A),扩增的基因片段长度分别为1 064、1 046和592 bp,包括3A、3B、3C、3D基因序列,3'UTR序列和一个至少含有29个Poly(A)的尾巴。序列分析结果表明,swKoV CH441株3D基因全长1 407 bp,编码468个氨基酸,分子质量约为53 369.29 D,理论等电点为6.12;3'UTR位于终止密码子TGA之后,长166 bp;swKoV CH441株与其他猪嵴病毒3D基因核苷酸序列相似性在92.2%-93.4%,氨基酸一致性为97.9%-99.4%。遗传进化分析表明,swKoV CH441株与国内株亲缘关系较近,与匈牙利株亲缘关系较远。

日本晚樱同源异型基因PrseAP3的克隆及其在单瓣与重瓣花中的表达分析

用同源克隆的方法和3′RACE技术,从日本晚樱(Prunus lannesiana)中分离得到了1个AP3同源基因PrseAP3的cDNA全长,GenBank登录号为JF710371。其cDNA全长977bp,包括1个编码235个氨基酸共708bp的开放阅读框。序列比对和分子系统发生分析表明,PrseAP3是拟南芥的AP3同源基因,其蛋白质的C末端具有2个保守基元:PI-derived模体和paleoAP3模体,属B类转录因子中paleoAP3进化系。半定量RT-PCR分析表明,PrseAP3主要在单瓣日本晚樱品种大岛的萼片、花瓣和雄蕊中表达;在重瓣品种一叶的花瓣、雄蕊和叶化心皮中表达。其表达组织特异性在2个品种间表现出明显的差异,并与拟南芥的AP3基因有一定的差别。

大豆疫霉根腐病菌的分离鉴定及种质资源对3号生理小种的抗性评价

采用下胚轴伤口接种法,用在黑龙江省建三江农场分离到的大豆疫霉菌3号生理小种对292份栽培大豆材料(其中农家品种153份、其它大豆栽培品种139份)和236份野生大豆材料进行了抗性鉴定。结果表明:栽培大豆资源抗病80份,占27.4%,中间类型93份,占31.8%,感病119份,占40.8%。153份农家品种中,抗病的有49份,占农家品种的32.0%,表明农家大豆品种资源抗性比例较高。野生大豆资源中抗病的有49份,占20.8%;中间类型55份,占23.3%;感病132份,占55.9%。鉴定的这些高抗资源可为我国大豆抗疫霉根腐病育种奠定基础。

运用3′RACE验证LongSAGE文库构建后白念珠菌不同菌相的差异表达基因

目的 鉴定从LongSAGE文库筛选到的白念珠菌不同菌相表达基因差异表达标签JMD8和JSW10所代表基因。方法 诱导白念珠菌菌丝相的表达后,运用3′RACE技术扩增白念珠菌差异表达基因标签基因片段,纯化回收后,T/A连接,经氯化钙法转化大肠杆菌,X gal/IPTG诱导表达,在阳性菌株中抽提质粒后酶切、测序。结果 两个片段均能在GenBank中找到同源序列,Score值小于40 ,Evalue小于0 5。结论 鉴定了白念珠菌LongSAGE标签JMD8和JSW 10代表的基因分别为EFT2和SHMII。

褐飞虱肌动蛋白基因3′末端克隆与测序

应用锚定的 3′ RACE方法 ,对褐飞虱Nilaparvatalugens (St l)肌动蛋白基因 3′末端进行了扩增、克隆和测序 ,并对所得到的 5个cDNA片段的不译端的序列进行了比较。结果显示 :BPH A和BPH D与其他序列不同 ;BPH B、BPH C和PBH E三条片段的不译端的序列很相似 ,只是长度不同。另外 ,所得序列中所含翻译区的氨基酸序列高度保守 ,根据肌动蛋白基因结构特点可以推断BPH A和BPH D属肌肉特异型肌动蛋白基因 ,BPH B、BPH C和BPH

茶树类黄酮3’,5’-羟化酶在大肠杆菌的表达和优化

儿茶素是茶叶主要特征和功能成分之一,其中B环三羟基儿茶素约占儿茶素总量的65%以上。类黄酮3’,5’-羟化酶是类黄酮合成中B环5’羟基化的唯一酶系,与B环三羟基儿茶素合成积累密切相关。采用RACE技术,克隆了茶树类黄酮3’,5’-羟化酶基因的1 944 bp的全长序列,开放阅读框区域为55～1 587 bp,编码510个氨基酸,推测其分子量为57.1 kDa,等电点为9.06。该基因重组至pET-32a(+)表达载体上,在大肠杆菌Rosetta中进行原核表达;优化了原核表达中温度诱导条件;利用钴离子吸附柱纯化了目的蛋白。该研究为开展F3’5’H酶的反应动力学、酶的器官组织定位等研究奠定了基础。

人HAS3启动子的结构与功能初步分析

透明质酸合酶3(hyaluronan synthase3,HAS3),是一个参与透明质酸合成的酶分子,在上皮形成和肿瘤转移等过程中起重要作用.为了进一步研究HAS3基因的转录调控机制,本研究克隆鉴定了HAS3基因的启动子.首先应用5′RACE(rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增)技术鉴定了HAS3基因的转录起始位点,发现了丰度和转录起始位点不同的两种新的HAS3基因剪接变异体.通过PCR定向克隆策略,构建了覆盖HAS3基因5′端侧翼区起始密码子ATG上游约4.3kb区域的一系列HAS3基因启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,HAS3基因启动子定位于转录起始位点附近约450bp的区域内.转录因子结合位点分析表明,HAS3基因启动子缺乏典型的TATA盒,但含有典型的GC盒以及C/EBP等其它潜在的转录因子结合位点.结果提示,Sp1和C/EBP等转录因子可能参与HAS3基因的转录调控.