Amplification of UGPase cDNA 3＇ UTR from Saccharum Officinarum

UDP-glucose pyrophosphorylase is an important enzyme concerned with carbohydrate metabolism in plants. Cloning of UGPase is a premise for further study on molecular level, and it is also crucial for study of carbohydrate metabolism. UGPase cDNA sequence as a template, designed primer, then 3＇-untranslate region （3＇ UTR） of UGPase were amplified by 3＇-rapid amplification of cDNA ends （3＇-RACE）. The results suggested the 3＇ UTR were 243 bp, contained AATAA sequence and Poly（A）.

ERK1/2信号通路基因3'UTR多态性与非小细胞肺癌的相关性

目的探究4个ERK1/2信号通路的基因3'UTR区域的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点(MAPK1基因中的rs9340,NRAS基因中的rs14804,KRAS基因中的rs712和rs7973450)与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的相关性。方法纳入了478名NSCLC患者及480名健康对照者,利用TaqMan探针法对其进行基因分型检测,并分析上述4个SNP与NSCLC的相关性。结果rs9340位点的等位基因在对照组与非小细胞鳞状细胞癌组(squamous cell carcinoma,SCC)中分布频率的差异具有统计学意义(P=0.009),该结果表明rs9340位点的G等位基因可能是非小细胞肺鳞癌的保护性因素(OR=0.67,95%CI:0.50~0.91)。同时,在<50岁年龄组中,rs9340位点的等位基因在对照组和NSCLC组中的分布频率差异具有统计学意义(P=5.07×10^(-4)),该结果表明rs9340等位基因G可能是NSCLC的保护性因素(OR=0.46,95%CI:0.29~0.72)。结论MAPK1基因SNP位点rs9340可能与NSCLC的发生风险相关。

狭缝引导配体13′UTR通过miR-34a-5p/SIRT1轴调节内皮细胞表型

在高等生物的进化过程中,mRNA的3′非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)序列显著增加,提示3′UTR在生物功能调节中可能发挥重要作用。我们发现狭缝引导配体1(slit guidance ligand 1,SLIT1)3′UTR在肥厚型心肌病(HCM)患者心肌中水平降低,但其对肥厚心肌中血管功能调节的作用机制不清楚。利用腺病毒介导在主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells,HAECs)中过表达SLIT13′UTR,检测HAECs中一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthases,eNOS)和血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor,VEGFA)表达。分别采用划痕实验和基于Matrigel胶的管腔形成实验检测HAECs的迁移和成管腔能力。结果发现,过表达SLIT13′UTR会升高HAECs中p-eNOS、eNOS和VEGFA水平(P<0.01),并促进HAECs迁移和成管腔能力(P<0.01)。生物信息学预测提示,SLIT13′UTR上有多个微RNA(miRNA)的潜在结合位点,反义RNA纯化技术(RNA antisense purification,RAP)筛选和利用Ago2抗体进行RNA结合蛋白质免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)结果显示,SLIT13′UTR与miR-34a-5p存在结合作用,而过表达SLIT13′UTR的HAECs中miR-34a-5p水平显著降低(P<0.05)。Western印迹结果证实,miR-34a-5p可逆转过表达SLIT13′UTR对去乙酰化酶SIRT1的上调作用(P<0.05)。在HAECs中转染miR-34a-5p和si-SIRT1,可一致地抑制过表达SLIT13′UTR引起的p-eNOS、eNOS和VEGFA增加(P<0.05,P<0.01),及促进HAECs迁移和成管腔的能力(P<0.01,P<0.001)。因此,SLIT13′UTR可以特异性吸附miR-34a-5p,通过miR-34a-5p/SIRT1轴发挥促进内皮细胞迁移和管腔生成的作用。

ZEB1-3′UTR促进乳腺癌细胞MCF-7迁移机制的研究

对与ZEB1-3′UTR结合的microR-NAs进行生物信息学分析。结果表明,与对照组相比,过表达ZEB1-3′UTR后MCF-7细胞迁移能力显著增强。采用RNA22、Microrna、Targetscan数据库筛选出与ZEB1-3′UTR结合的microRNAs,三个数据库公共预测的microRNAs有9个,分别是miR-429、miR-200b、miR-200c、miR-494、miR-873、miR-381、miR-300、miR-431和miR-342,其中miR-429、miR-200b、miR-200c、miR-342在乳腺癌中高表达。以上研究表明,ZEB1-3′UTR能够竞争性结合肿瘤细胞表达的内源性microRNAs,促进了MCF-7细胞迁移。

LGALS3BP 3’UTR荧光素酶报告基因载体构建及鉴定

目的构建LGALS3BP(lectin,galactoside-binding,soluble,3 binding protein,LGALS3BP)基因3’非编码区(3’-untranslated region,3’UTR)的野生型及突变型荧光素酶报告基因重组载体并进行鉴定,以备进一步研究miRNA对LGALS3BP基因的调控。方法Targetscan软件预测LGALS3BP 3’UTR上的miRNA结合位点;以人肝癌细胞系SMMC-7721基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得野生型LGALS3BP基因3’UTR片段,经双酶切将目的片段定向插入报告基因载体pGL3-Control中,将克隆好的重组载体转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞进行扩增,采用菌落PCR及测序监定重组子。设计位点突变型LGALS3BP 3’UTR扩增引物,以构建的野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒为模板,采用重叠PCR及定点突变PCR技术进行扩增分别构建单独位点及双位点突变型重组荧光素酶报告基因载体。结果野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒经菌落PCR鉴定,可见871 bp的目的基因片段,大小与预期相符;测序结果表明,插入序列与LGALS3BP 3’UTR序列完全一致且插入方向正确。Targetscan软件预测到LGALS3BP 3’UTR区有两个感兴趣的miRNA结合位点。突变型LGALS3BP 3’UTR重组质粒测序鉴定结果表明,单独位点及双位点突变型重组质粒中均成功引入结合位点突变。结论成功构建LGALS3BP的3’UTR野生型(pGL3-LGAL-W-3’UTR)、两个单独位点突变型(pGL3-LGAL-M1-3’UTR和pGL3-LGAL-M2-3’UTR)及双位点突变型(pGL3-LGAL-M-3’UTR)重组荧光素酶报告基因载体,为后续研究miRNA对LGALS3BP基因的调控奠定基础。

关岭牛MSTN基因3'-UTR与bta-miR-27b的靶向验证

【目的】明确关岭牛bta-miR-27b与肌肉生长抑制素基因(MSTN)的结合位点及靶向调控关系,为通过调控miRNA改良关岭牛产肉量提供理论依据,也为贵州地方黄牛分子遗传改良工作提供新的切入点。【方法】通过TargetScan预测牛MSTN基因3'端非翻译区(3'-UTR)的潜在miRNA结合区域及互作miRNA,对比关岭牛与不同关岭牛杂交品种的生理表型及MSTN基因和3'-UTR端miRNA表达差异,并分析bta-miR-27b在不同关岭牛杂交群体中的靶位点特异性。将MSTN基因3'-UTR序列野生型(WT)和3'-UTR序列突变型(MUT)分别克隆至pMIR-REPORT Luciferase(H306)载体构建重组双荧光素酶报告基因载体,与bta-miR-27b共转染293T细胞以验证bta-miR-27b与MSTN基因的作用关系,并利用实时荧光定量PCR验证bta-miR-27b对MSTN基因表达的影响。【结果】在牛MSTN基因3'-UTR端发现7个miRNA结合位点;关岭牛各系杂交品种的3个miRNA(bta-miR-27a-3p、bta-miR-27b和bta-miR-128)相对表达量均极显著高于关岭牛(P<0.01,下同),MSTN基因相对表达量极显著低于关岭牛,体质量、体高、体斜长、胸围等生长指标却明显优于关岭牛。关岭牛及其杂交牛MSTN基因3'-UTR端的bta-miR-27b结合区域均无突变、无缺失;MSTN-3'-UTR(WT)与bta-miR-27bmimics共转染293T细胞后其相对荧光值下降53.80%,极显著低于MSTN-3'-UTR(MUT)+bta-miR-27bmimics共转染;转染bta-miR-27b mimics后,bta-miR-27b在关岭牛原代成肌细胞株(N2)中成功超表达,而MSTN基因相对表达量呈极显著下调趋势,表明bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。【结论】bta-miR-27b与MSTN基因的结合区域位于3'-UTR端第62~69位碱基处,且靶位点保守性较高。bta-miR-27b对MSTN基因有很强的靶向调控作用,表现为bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。

长顺绿壳蛋鸡GRIN1基因3′非翻译区的多态性及其与蛋壳品质的关联性

【目的】探索长顺绿壳蛋鸡GRIN1基因3′非翻译区(untranslated region,UTR)多态性对蛋壳品质的影响。【方法】选择185只健康蛋鸡,测定其第45周龄产蛋的蛋质量、蛋形指数、蛋壳强度、蛋壳厚度和蛋壳质量5个指标;使用NCBI和PrimerPremier 3.0设计引物,采用正向测序法筛选GRIN1基因在3′UTR区域的SNP位点。【结果】GRIN1基因的3′UTR检测到4个SNP位点:g.30871C>T、g.31017A>G、g.31158A>C和g.31166G>C,其中仅g.31158A>C和g.31166G>C之间存在强连锁不平衡,且g.30871C>T和g.31017A>G都极显著偏离哈代—温伯格平衡(P<0.01)。g.31017A>G与蛋壳品质的关联分析中,GG基因型的蛋质量显著高于AA基因型(P<0.05)。4个SNP位点共产生5个单倍型(H1、H2、H3、H4、H5)和8个双倍型(H1H1、H1H2、H1H3、H2H2、H2H3、H2H4、H3H5、H4H4),双倍型H3H5的蛋质量显著高于双倍型H2H2和H2H3(P<0.05),双倍型H3H5的蛋壳质量显著高于双倍型H2H2(P<0.05),其他双倍型指标间的差异未达到显著水平(P>0.05)。【结论】长顺绿壳蛋鸡GRIN1基因与蛋壳品质存在显著关联;g.31017A>G对蛋壳品质有显著影响,能够作为改善蛋壳品质的分子标记位点参考。

鸡IGFBP2基因3′UTR区1196C>A单核苷酸多态性的功能性鉴定及分析

鸡IGFBP2基因3′非编码区(3′UTR)1196C>A单核苷酸多态性(SNP)与鸡的腹脂重和腹脂率显著相关.生物信息学分析显示,该SNP恰好位于gga-mi R-456-3p的一个潜在靶基因结合位点处,提示IGFBP2基因可能是gga-mi R-456-3p的一个靶基因,且该SNP位点可能影响gga-mi R-456-3p对IGFBP2基因表达的调控作用.为鉴定SNP 1196C>A是否为功能性SNP,本研究分别构建了包含该SNP位点C或A等位基因的双荧光素酶报告基因载体,比较分析这两个等位基因在鸡胚成纤维细胞系(DF1)和鸡前脂肪细胞中对报告基因活性和表达的影响;利用mi RNA mimics和inhibitor分析gga-mi R-456-3p对不同等位基因报告基因活性以及内源性IGFBP2表达的影响.结果发现,在DF1细胞和鸡前脂肪细胞中,A等位基因的报告基因活性和表达均显著高于C等位基因(P<0.05);gga-mi R-456-3p仅影响C等位基因的报告基因活性和表达,而对A等位基因的报告基因活性没有明显影响;gga-mi R-456-3p调控细胞内源性IGFBP2基因的m RNA和蛋白质表达.本研究证实IGFBP2基因是gga-mi R-456-3p的靶基因,其3′UTR区SNP 1196C>A是一个功能性SNP,它影响gga-mi R-456-3p对鸡IGFBP2基因的表达调控作用.本研究结果对于鸡的分子辅助选择育种及IGFBP2基因在脂肪沉积中调控机制的阐明具有重要意义.

瑞氏木霉EGⅠ3′-UTR对基因在酿酒酵母中表达的影响

将纤维素降解菌丝状真菌瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ (EGⅠ )全长cDNA克隆于酿酒酵母H1 58中得到表达。重组酿酒酵母产生的EGⅠ的最适pH值为 5 0 ,最适作用温度为 50℃～ 60℃。EGⅠcDNA中的 3′ 非翻译区 (3′ UTR)序列的删除导致EGI基因在酵母菌中没有活性产物表达。通过RT PCR技术检测EGⅠmRNA转录水平的结果表明 ,带有 3′ UTR的EGⅠcDNA在酿酒酵母中具有明显的转录产物生成 ,但删除 3′ UTR之后的EGⅠcDNA却检测不到转录产物。这说明EGⅠ的 3′ UTR对基因在酵母菌中的表达具有重要作用。

家兔BMP7基因3′UTR的克隆及序列分析

【目的】研究家兔BMP7基因3′非翻译区(3′UTR)序列的结构及功能特点。【方法】以家兔肾脏组织为材料,应用3′RACE技术对家兔BMP7基因3′UTR序列进行扩增,并与GenBank中登陆的其他哺乳动物相应序列进行比较分析。【结果】成功克隆了家兔BMP7基因的3′UTR(GenBank号:EU004072);在3′UTR序列末端存在2个切割与胞质多聚腺苷化特异因子(CPSF)结合位点(AAUAAA)和1个11 bp的poly(A)。家兔BMP7基因3′UTR序列与小鼠、人、牛和猪的一致性分别为41.45%,50.30%,47.84%和57.91%,相对不保守。【结论】家兔BMP7基因3′UTR结构特点可能与其基因功能有关。

家鹅Myostatin基因3-′UTR序列分析

利用家鹅Myostatin基因第3外显子设计上游引物、家鸡Myostatin3-′UTR设计下游引物,PCR扩增并克隆出家鹅该基因3-′UTR长1 064bp DNA序列。该序列具有一个polyA加尾信号序列(TAATAAA),并富含连续的TTTT高保守区。分析家鹅与其他12个物种该序列的同源性发现,其与家鸡的同源性最高,达87.1%,与鱼类的最低(<11%)。以13个物种Myostatin3-′UTR构建的分子进化树表明,3′UTR能够为动物进化提供一定信息,但适用于较低分类阶元。

TNF-α3′-UTR双荧光素酶报告基因系统的构建及丹参酮类药物筛选

目的构建并鉴定p GL3-TNF-α3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统,以此基于调控TNF-α转录后水平对丹参酮类成分进行筛选。方法反转录人脐静脉内皮细胞HUVEC的mRNA成c DNA,以之为模板,PCR扩增含TNF-α3'-UTR的DNA片段全长,经酶切后连接至荧光素酶报告载体p GL3-control上,构建出p GL3-TNF-α3'UTR全长的荧光素酶报告基因载体并进行鉴定。将所构建的p GL3-TNF-α3'UTR与p SVRenilla质粒组成双荧光素酶报告系统共转染至单核巨噬细胞RAW264.7,经脂多糖诱导后利用该双荧光素酶报告基因表达系统判定丹参酮类成分对TNF-α转录后调控是否有影响。结果成功构建p GL3-TNF-α3'UTR荧光素酶报告基因,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致。脂多糖(LPS)可以明显诱导转入p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光强度。丹参酮类成分中隐丹参酮可以明显降低LPS诱导的p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光素酶活性。结论成功构建含TNF-α3'UTR区的双荧光素酶报告基因表达系统,并以此从丹参酮类化合物中筛选出隐丹参酮,可以对TNF-α的转录后水平进行抑制调控。

草鱼醛缩酶A3'-UTR突变与生长性状相关研究

采用直接测序法筛选草鱼(Ctenopharyngodon idella)醛缩酶A 3'-UTR突变位点,发现其转录终止密码子后58 bp处存在17 bp的插入片段。对草鱼养殖群体的插入突变进行分型,检测到该群体有AA、BB、AB三种基因型,等位基因B在群体中的频率为0.723,处于Hardy-weinberg平衡,多态信息含量是0.32,此突变在所测群体中属于中等遗传变异。利用一般线性模型分析基因型与草鱼群体生长性状(体重、体长、体高、体宽)的相关性,结果表明:醛缩酶A 3'-UTR突变与草鱼体宽和吻长2个生长性状达到显著相关(P<0.05),BB基因型个体比AA基因型个体的体重增加8.37%,在全长、体长、体高、尾柄长等生长性状也表现出比AA和AB基因型个体好。可将醛缩酶A 3'-UTR上的这段插入突变位点作为草鱼生长性状的候选分子标记用于草鱼的选育。

草原红牛胰岛素样生长因子Ⅰ受体基因3′UTR序列多态性分析

以58头草原红牛为试验材料,采用PCR-SSCP技术对胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGF-ⅠR)基因3′UTR序列多态性进行了检测。结果表明,在IGF-ⅠR基因3′UTR中发现PCR-SSCP的多态位点,有2种等位基因和3种基因型。对所得基因型与生长和胴体性状的相关性分析结果发现,在3′UTR中AB型的胴体产肉率、肉骨比显著高于AA、BB型(P<0.05);AA型的脂肪覆盖率显著高于BB型(P<0.05),与AB型差异不显著(P>0.05)。

沙棘耐盐基因HrNHX1的克隆及3'UTR序列分析

以沙棘(Hippophae rhamnoides L.)叶片为材料,用改良SDS法提取总RNA,反转录合成第一链cDNA作为模板,根据已公布NHX1家族同源序列保守区设计简并引物,扩增出沙棘中HrNHX1基因的中间序列,然后用快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA end,RACE)方法,从沙棘中克隆到HrNHX13'cDNA序列。该序列(GenBank登录号:EU718492)长度为1373bp,与已知NHX1序列同源性最大为80%,其编码区1094bp,编码364个氨基酸,3'非翻译区(3'-untranslated region,3'UTR)长度为239 bp。3'UTR序列分析显示沙棘的3'UTR与陆地棉、葡萄柚和小盐芥的同源性分别为43.97%、45.63%和40.64%,明显低于编码区的同源性。结果表明,NHX1基因编码区具有较高的保守性,3'UTR序列的同源性较低,显示了非编码区在环境适应中的重要性,并为进一步研究沙棘对生境的适应分子机制奠定了基础。

转录靶向猪瘟病毒3'-UTR shRNA细胞株的初步建立

利用质粒载体在细胞内转录并加工成siRNA的方法,设计3对针对猪瘟病毒3'-UTR不同位点的干扰片段,分别与干扰载体pGenesil-1连接,转化DH5α,筛选阳性克隆得到重组干扰质粒pGene-1,pGene-2和pGene-3,脂质体介导转染重组干扰质粒于PK-15细胞,G418抗性筛选得到转录靶向猪瘟病毒3'-UTR shRNA的PK-15细胞株,为今后应用RNAi研究猪瘟病毒3'-UTR调控病毒复制的功能以及抑制猪瘟病毒增殖的研究奠定了基础。

奶牛OLR1 3'UTR A223C多态的生物学信息分析

[目的]探索氧化型低密度脂蛋白受体OLR1 3'UTR A223C多态与奶牛乳脂率高低紧密关联的分子机制。[方法]用miRanda(1.0)软件装载牛microRNA数据库,预测OLR1 3'UTR潜在的microRNA。[结果]共预测16个microRNA靶标,OLR1 3'UTR A223C突变定位于bta-miR-370靶标种子序列的互补区。[结论]由于OLR1 3'UTR A→C突变导致bta-miR-370靶标的消失,为OLR1 3'UTR A223C多态与奶牛乳脂率高低紧密关联的分子机制深入研究提供依据。

转录靶向猪瘟病毒3′-UTRshRNA细胞株干扰猪瘟病毒增殖的检测

对筛选的转录猪瘟病毒石门株3-′UTR shRNA的PK-15细胞株P-1（114-132位）、P-2（136-154位）和P-3（209-227位）分别接种猪瘟病毒（CSFV）,在接毒后第72和96小时用半定量反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测CSFVNS3基因及-βactin基因,以研究构建细胞株在转录水平上对CSFV增殖干扰的效果;接毒后第72、96和148小时以酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测细胞NS3蛋白表达量,通过OD490值分析构建细胞株在病毒蛋白表达水平上对CSFV增殖的影响。检测结果表明：（1）接毒后第72和96小时P-1、P-2和P-3细胞株中NS3基因的量明显减少,与接毒的空白PK-15细胞比较差异显著（P〈0.05）,说明P-1、P-2和P-3细胞株转录的shRNA能干扰CSFV RNA的转录;（2）接毒后第72和96小时P-1、P-2、P-3细胞株中NS3蛋白的表达量明显少于接毒的PK-15细胞（P〈0.05）,说明转录的shRNA在病毒蛋白水平上能干扰CSFVNS3基因的表达,但接毒后第148小时干扰效果有所降低。

人Bcl-6 3'UTR区报告质粒及其表达载体的构建和功能检测

目的通过构建bcl-6基因野生型、突变体3'UTR区及其编码序列(CDS),观察miR-127对bcl-6的直接靶向调控作用及bcl-6表达载体回复miR-127抑制细胞周期和细胞生长的功能。方法利用PCR方法扩增bcl-6基因3'UTR区序列及其CDS,分别构建在pc DNA3.0-Luc和pc DNA3.0-Flag载体上,在bcl-6基因3'UTR质粒基础上应用重组PCR方法构建miR-127结合位点突变的突变体报告基因质粒,应用荧光素酶报告基因系统检测miR-127对bcl-6的直接靶向调控作用,在肝癌细胞Hep G2中检测过表达及敲低miR-127引起bcl-6基因表达抑制后细胞周期和细胞生长的改变,同时应用表达载体回复bcl-6蛋白水平,检测bcl-6在miR-127调控细胞周期和细胞生长中的必要性。结果构建的重组质粒经酶切鉴定和测序证实构建正确,bcl-6 3'UTR野生型和突变体报告质粒与miR-127共转293T细胞和Hep G2细胞后荧光素酶报告基因检测显示miR-127明显降低野生型报告质粒的活性,但对突变体活性没有影响,miR-127可引起Hep G2细胞G2/M期阻滞并抑制细胞生长,bcl-6可以逆转miR-127对细胞周期和细胞生长的影响。结论成功构建bcl-6基因3'UTR区野生型、突变体报告质粒和bcl-6基因的表达载体,荧光素酶报告基因和回复实验证实均具有生物学功能。

NOTCH1基因3＇-UTR段双荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定

目的:构建含NOTCH1基因3'-UTR段双荧光素酶报告载体,并验证其活性。方法:使用PCR方法扩增含NOTCH1基因3'-UTR区序列,插入到双酶切的双荧光素酶报告载体中;使用生物信息学方法预测可能与NOTCH1基因3'-UTR相互作用的miRNA;使用lipofectamine 2000转染试剂将重组质粒或空质粒和miR-34a inhibitor或control真核表达载体共转染HEK293T细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。结果:得到含NOTCH1基因3'-UTR(1 648 bp)序列的双荧光素酶报告重组质粒,并用凝胶电泳和基因测序的方法验证。NOTCH1基因3'-UTR上可能有miR-34a的调控作用靶点;用重组质粒和miR-34a inhibitor共转染的HEK293T组的荧光素酶活性比空质粒组高45%。结论:含NOTCH1基因3'-UTR双荧光素酶报告载体构建成功,miR-34a对NOTCH1基因有调控作用。