重组结核分支杆菌38kD和16kD蛋白用于结核病血清学诊断的价值

目的 探讨国产重组结核分支杆菌蛋白 38kD(rTPA38)和 16kD(rTPA16)用于结核病的诊断价值。方法 以rTPA38和rTPA16为抗原 ,PPD为对照 ,用ELISA法检测血清中特异性抗结核抗体。结果 2 4 6例肺结核病组 ,rTPA38、rTPA16和PPD检测的灵敏度分别为 66.3%、63.0 %和 72 .3%。健康献血组、非结核呼吸疾病组和卡介苗接种阳转组血清同时用rTPA38、rTPA16和PPD检测 ,rTPA38特异性分别为 97.6%、96.8%、86.0 %。rTPA16特异性分别为 94 .7%、93.1%、75 .0 %。PPD特异性为93.4 %、85 .7%、67.9%。统计分析显示 ,rTPA38蛋白和PPD检测非结核呼吸疾病组 ,其阳性率有显著性差异 (P <0 .0 5 )。两者检测卡介苗接种阳转组阳性率和血清抗体滴度有显著性差异 (P <0 .0 5 )。rTPA38和rTPA16同时检测 10 8例肺结核病组血清可提高 11.1%的阳性率。结论 rTPA38蛋白抗原有较好的灵敏度和较高特异性 ,是ELISA的可靠抗原 ,与rTPA16联用可提高灵敏度 ,对结核病血清学诊断有较高参考价值。

I型马立克氏病毒38kD磷蛋白与Ⅱ和Ⅲ型病毒间的交叉免疫反应

由致病性Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)特异性的单克隆抗体H_(19)制备亲和层析柱,从感染重组杆状病毒BP38Ⅱ的昆虫细胞系Sf9细胞中提纯MDV的pp38基因表达产物,以此免疫小鼠制备抗血清,测定其与不同型MDV毒株感染的鸡胚成纤维细胞免疫反应性,同时也用不同型MDV毒株(HVT,Z4)制备的抗血清和自然感染发病鸡血清分别与感染重组病毒的Sf9细胞进行免疫交叉反应.试验结果表明,完整的Ⅰ型MDV来源的pp38基因产物与所试Ⅱ型Z4株和Ⅲ型HVT Fc126毒株在抗原性上有显著交叉反应.这一结果表明,在Ⅱ型和Ⅲ型MDV毒株中可能存在着pp38的类似物.

结核分支杆菌38KD蛋白基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的构建和克隆结核分枝杆菌38kD蛋白的基因,以转基因技术导入大肠杆菌,诱导表达,以获得大量38kD抗原。方法根据GenBank上编码38kD蛋白的基因系列,设计一对特异引物,通过PCR技术从结核分支杆菌H37Rv基因扩增出38kD蛋白基因片段;目的基因连接到克隆载体pMD18-TSimple Vector,测序鉴定,目的片段双酶切下来克隆到原核表达载体pET-30a中,成功构建成带有N末6His-tag的融合表达载体。表达载体用化学转化法转化E·coliBL21(DE3),用菌落PCR筛选得到阳性克隆;经1mmol/LIPTG诱导4h表达外源蛋白;而且在37℃时蛋白表达量最高;二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果。结果38kD序列与GenBank报道完全一致;用菌落PCR筛选得到阳性克隆;经1mmol/LIPTG诱导4h表达外源蛋白;而且在37℃时蛋白表达量最高;二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果显示,在大约38kD处有表达产物特异条带;可溶性分析表明,该重组蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在;纯化的包涵体纯度达到90%。结论获得38kD蛋白工程菌株,为将此抗原用于临床诊断应用打下基础。

重组结核分枝杆菌黏附素、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值比较

目的探讨重组结核分枝杆菌黏附素(heparin-binding hemagglutinin adhesin,HBHA)、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值。方法选取结核性胸腔积液患者54例、恶性胸腔积液患者40为研究对象,以HBHA、MPT64、38kD蛋白为抗原,通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测患者胸腔积液中IgG抗体滴度。结果结核性胸腔积液组3种抗原对应的IgG抗体吸光度均数分别为0.630,0.430,0.470;恶性胸腔积液组3种抗原对应抗体吸光度均数分别为0.340,0.248,0.271,结核组高于恶性胸腔积液组,差异有统计学意义(P<0.001);ROC曲线分析结果显示,胸水中HBHA抗体的诊断临界值定为0.46时用于鉴别诊断结核性胸膜炎和癌性胸水的敏感度为90.7%、特异度为90.0%、准确度为90.4%。诊断准确度高于MPT64及38kD蛋白。结论 HBHA蛋白抗体对于结核性胸膜炎与癌性胸水的鉴别诊断具有重要价值,优于MPT64及38kD蛋白。

重组结核分枝杆菌黏附素、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值比较

目的探讨重组结核分枝杆菌黏附素（heparin-bindinghemagglutininadhesin，HBHA）、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值。方法选取结核性胸腔积液患者54例、恶性胸腔积液患者40为研究对象，以HBHA、MPT64、38kD蛋白为抗原，通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测患者胸腔积液中IgG抗体滴度。结果结核性胸腔积液组3种抗原对应的IgG抗体吸光度均数分别为0．630，0．430，0．470，恶性胸腔积液组3种抗原对应抗体吸光度均数分别为0．340，0．248，0．271，结核组高于恶性胸腔积液组，差异有统计学意义（P〈0．001）；ROC曲线分析结果显示，胸水中HBHA抗体的诊断临界值定为0．46时用于鉴别诊断结核性胸膜炎和癌性胸水的敏感度为90．7％、特异度为90．0％、准确度为90．4％。诊断准确度高于MPT64及38kD蛋白。结论HBHA蛋白抗体对于结核性胸膜炎与癌性胸水的鉴别诊断具有重要价值，优于MPT64及38kD蛋白。

马立克病病毒疫苗株CVI988的38kd磷蛋白基因双氨基酸突变株

利用单克隆抗体H1 9及间接免疫荧光抗体反应 (IFA) ,从经马立克病病毒 (MDV)强毒株Md1 1的38kd磷蛋白 (pp38)基因克隆质粒DNA转染的MDV疫苗毒CVI988株感染的鸡胚成纤维细胞中 ,筛选到一个点突变株CVI/rpp38(AA)。DNA序列测定结果表明 ,该点突变株pp38基因ORF的第 32 0位和 32 6位碱基均已从亲本CVI988株的“G”突变为“A” ,导致第 1 0 7和 1 0 9位氨基酸分别从精氨酸和甘氨酸转变为谷氨酰胺和谷氨酸。这个双氨基酸点突变株在IFA和免疫沉淀反应中与pp38特异性单抗H1 9都呈现阳性反应 ,但与另一个 pp38特异性单抗T6 5都完全不反应 ,表现出与亲本病毒完全相反的结果。本研究发现了MDV的pp38上二个特异性不同的抗原表位 ,并以确凿的证据证明了第 1 0 7及 1 0

结核分枝杆菌38kD蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的分泌性表达

目的:构建含结核分枝杆菌38kD蛋白基因的真核表达载体并转染HEK293T细胞,高效表达分泌性38kD蛋白。方法:设计合成的结核分枝杆菌38kD基因被克隆到T载体,然后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切鉴定正确后,PEI转染法导入293T细胞,换不含血清的DMEM培养基培养3 d后收集细胞及上清,采用Western印迹检测38kD蛋白的表达。结果:酶切结果显示,获得正确的含38kD基因的重组表达载体;Western印迹结果显示表达载体导入293T细胞中后能在细胞及上清中检测到38kD蛋白表达。结论:构建了含重组结核分枝杆菌38kD蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.0-38kD,该载体可在哺乳动物细胞HEK293T中高效分泌性表达38kD蛋白,为结核病诊断试剂盒研发奠定了基础。

表达强毒pp38决定簇的马立克病病毒疫苗毒CVI988点突变株的构建和特性

用鸡马立克病病毒（ＭＤＶ）强毒ＧＡ株的３８ｋＤ磷蛋白（ｐｐ３８）基因克隆ＤＮＡ转染Ⅰ型弱毒疫苗ＣＡＩ９８８／Ｒｉｓｐｅｎｓ株ＭＤＶ感染的鸡胚成纤维细胞，再用能识别Ⅰ型强毒ｐｐ３８的单克隆抗体Ｈ１９做免疫荧光试验，筛选到能在ｐｐ３８基因上表达强毒株特异性抗原决定簇的定向点突变弱毒株ＣＶＩ／ｒｐｐ３８。用３５Ｓ－蛋氨酸标记的细胞裂解物做免疫沉淀反应表明，单抗Ｈ１９不能识别天然ＣＶＩ９８８株ＭＤＶ中的ｐｐ３８，但却能从感染了重组病毒ＣＶＩ／ｒｐｐ３８的细胞识别出ＭＤＶｐｐ３８蛋白带，如同从ＭＤＶ的其它强毒株识别出ｐｐ３８一样。接种了ＣＶＩ／ｒｐｐ３８病毒的鸡，其ＭＤＶ特异性抗体滴度显著低于接种了原疫苗毒ＣＶＩ９８８／Ｒｉｓｐｅｎｓ克隆株的鸡，这进一步证明了强毒ＭＤＶ的ｐｐ３８具有免疫抑制作用。

结核杆菌重组基因16kD-38kD融合蛋白诊断结核病的应用价值

目的:构建结核杆菌16kD-38kD重组融合基因,纯化16kD-38kD融合抗原,进一步评价其在结核病血清学诊断中的应用价值。方法:通过构建重组结核杆菌16kD-38kD融合基因工程菌株,经亲和层析纯化融合蛋白,以此蛋白为抗原,建立金标免疫层析法检测结核病人血清中的特异性抗体,同时与单一的16kD重组蛋白和18kD重组蛋白进行比较。结果:16kD、38kD、16kD-38kD三种重组抗原检测肺结核病人血清201份检出率分别56.2%(113/201)、57.7%(116/201)、73.6%(148/201),融合蛋白抗原阳性检出率明显高于单一重组蛋白抗原,对菌阳血清的检出率达到81.9%;检测健康体检血清179份阴性符合率分别为87.2%(156/179)、89.9%(161/179)、88.8%(159/179),三种蛋白无明显差异。结论:16kD-38kD融合蛋白具有较好的敏感性和特异性,与单一使用两种蛋白比较,对结核病人血清抗体的检出率有很大的提高,在结核病血清学诊断中有较高的参考价值。