口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的克隆及3AB基因的原核表达

从感染口蹄疫病毒 (foot- and- m outh disease virus,FMDV)的细胞中提取总 RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT- PCR)获得了长度约为 14 0 0 bp的核酸片段 ,与预期长度相符。扩增产物经克隆后 ,测序证明其含有完整的 3ABC基因。该序列与国外参考序列 0 1K/ 6 6相比 ,同源性在 99%以上。亚克隆 3ABC基因至表达载体 p Tri Ex- 4 Neo中 ,通过序列分析发现 ,克隆到 p Tri Ex- 4 Neo载体上的片段于 3ABC基因 70 9～ 72 5 bp之间有 17bp的缺失 ,碰巧在 3AB基因后形成一终止密码子 ,但 3AB基因的阅读框架完整。选出含有 3AB基因完整阅读框架的阳性克隆 ,用 IPTG诱导表达 ,收集菌液进行 SDS- PAGE电泳、Western blotting分析 ,结果表明 ,3AB基因在大肠杆菌中成功表达 ,其表达产物为分子质量 33.5 ku的融合蛋白 ,并能被口蹄疫病毒阳性血清识别。经薄层扫描分析 ,表达的目的蛋白占总蛋白量的 2 6 %以上。该项研究为应用重组

口蹄疫病毒2C′3AB基因重组杆状病毒的构建及其表达

将含有口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白2C部分基因编码区及3AB完整基因编码区的基因片段2C′3AB重组于杆状病毒穿梭质粒pMelBac-B,经PCR、酶切及序列分析鉴定正确后,命名为pMel-2C′3AB。将重组穿梭质粒pMel-2C′3AB与杆状病毒骨架共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选及PCR鉴定,构建了含有目的基因的重组杆状病毒。用该病毒感染High Five细胞,细胞裂解液的SDS-PAGE电泳结果显示,出现一约为43ku的蛋白带,与预期大小一致;Western-blotting结果表明,该表达产物能被FMDV阳性血清及2C′3AB单克隆抗体识别;间接ELISA结果显示,表达的目的蛋白能与牛、羊、猪的O型FMDV阳性血清发生特异性反应。证实,FMDV 2C′3AB基因在昆虫细胞中得到了表达,且表达产物具有良好的反应活性。

表达口蹄疫病毒3AB基因的伪狂犬病毒载体的构建

为了获得口蹄疫病毒3AB基因重组伪狂犬病毒载体,试验以伪狂犬病毒TK/gⅠ缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,用限制性内切酶AscⅠ酶切基因组获得含完整PK基因的8.7 kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ多克隆位点获得中间载体P8-AA;用限制性内切酶SacⅠ+NdeⅠ酶切质粒P8-AA,切去PK基因中的2 218 bp片段,在质粒P8-AA的PK基因缺失区插入已构建好的质粒pEGFP-3AB中含绿色荧光蛋白(EGFP)基因和3AB基因的完整表达盒,转染于猪肾细胞。结果表明:成功构建出可以用于同源重组的转移载体P8-EGFP-3AB,并且在猪肾细胞中成功表达了绿色荧光蛋白基因。

猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB基因在重组杆状病毒中的表达与鉴定

利用PCR方法扩增获得EMCV非结构蛋白3AB基因,并将其克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM中,提取阳性克隆质粒转化至DH10Bac感受态细菌,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到重组杆状病毒穿梭载体Bacm id-3AB,经脂质体介导转染sf9细胞获得重组杆状病毒,并IFA和W estern b lotting鉴定其抗原性。结果表明,EMCV 3AB基因在昆虫细胞中获得成功表达,分子量约16 ku,具有良好的EMCV抗原性。因此利用杆状病毒表达系统成功表达了EMCV 3AB基因,为该病毒抗原表位和诊断方法研究奠定了重要基础。

口蹄疫病毒3AB基因的克隆与原核表达

根据口蹄疫流行毒株设计一对包含3AB部分基因编码区的特异性引物,扩增出3AB基因550 bp的特异带,并将纯化的扩增产物克隆到pM D 18-T载体上。再用设计的酶切位点将3AB基因分别连接到两种原核表达载体上,构建了重组质粒pETCK S-3AB及pET 28a-3AB,转入BL 21菌中进行原核表达。SDS-PAGE电泳表明,3AB基因在两种表达系统中均高效表达。对表达的蛋白通过包涵体及切胶纯化的方法进行纯化,获得了高纯度的3AB蛋白。

口蹄疫病毒3AB基因的表达及活性分析

通过重叠PCR合成口蹄疫病毒3AB基因,构建原核表达载体pGEX-5X-1/3AB,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。重组蛋白主要以包涵体的形式表达,将包涵体洗涤溶解后,采用Na2+离子金属螯合亲和层析柱纯化,逐步透析法复性。ELISA实验表明,目的蛋白能与猪口蹄疫阳性血清发生特异性反应。本研究为建立以基因工程产品为抗原、鉴别诊断自然感染和免疫动物的方法提供了技术条件。

口蹄疫病毒非结构蛋白基因的克隆表达及免疫活性的研究

从口蹄疫病毒(FMDV)细胞培养物中提取总RNA,设计简并引物通过RT-PCR获得了完整的3ABC基因片段,将3AB基因和部分3ABC基因分别克隆到原核表达载体上构建重组表达质粒pET-3AB和pET-3ABC,然后转化BL21(DE3)plysS进行诱导表达,将表达产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。结果表明,3AB基因和3ABC基因可以在大肠埃希菌中高效表达,且表达产物能够与FMDV阳性血清产生免疫反应。进一步摸索重组蛋白的纯化条件,制备纯化蛋白,以纯化的表达产物为包被抗原进行间接ELISA检测,结果表明,重组蛋白具有特异的免疫学活性,能够用于鉴别FMDV感染动物血清和免疫动物血清。