小麦慢叶锈QTL位点QLr.hebau-3DS的SSR标记开发

小麦叶锈病是小麦中分布最广的主要病害之一。挖掘抗病基因、选育抗病品种是防治小麦叶锈病最经济、安全、有效的方法。本课题组前期研究中发现农家品种‘平原50’表现出优良的慢叶锈性,利用平原50/铭贤169 DH群体,在‘平原50’中定位了位于3DS染色体上的QLr.hebau-3DS基因,该基因能在多个环境中稳定检测到,表现出优良的抗叶锈性。本试验通过成株期对平原50/铭贤169 DH群体进行抗叶锈鉴定,并利用小麦参考基因组序列开发SSR分子标记,研究结果表明平原50/铭贤169 DH群体在田间表现出连续性分布,其抗性由多个微效基因控制;开发了5对在‘平原50’和‘铭贤169’中表现多态性的SSR分子标记,其中2对分子标记SSR126和SSR208与QLr.hebau-3DS紧密连锁。本研究为下一步QLr.hebau-3DS的图位克隆和慢锈抗病品种的培育奠定了基础。

新生儿ABO*A2.08亚型等位基因的鉴定及蛋白结构分析

目的:研究ABO*A2.08亚型的血清学特征和蛋白结构,探究其遗传学分子机制。方法:利用血清学方法对先证者及其家系成员进行ABO血型鉴定,应用聚合酶链反应-序列特异性方法进行ABO基因分型,并对ABO基因第6、7外显子直接测序分析,通过同源蛋白保守性分析、3D分子建模和蛋白稳定性预测探究A2.08亚型中基因突变对GTA蛋白结构稳定性的影响。结果:先证者血清学结果为Ax亚型,ABO基因分型明确先证者的基因型为ABO*A207/08;先证者的父亲基因测序结果证实ABO基因第7外显子存在c.539G>C特征性变异,导致多肽链p.Arg180Pro(R180P)替换。3D蛋白分子建模与分析提示R180P突变后蛋白结构中局部氨基酸的氢键数目发生改变,蛋白稳定性预测显示该突变对蛋白结构稳定性影响较大。结论:ABO基因第7外显子c.539G>C突变导致多肽链氨基酸替换,影响了GTA蛋白结构的稳定性,引起酶活性改变,产生A2.08表型,且该变异基因可稳定遗传。

2012年猪嵴病毒流行病学调查及3D基因的遗传变异分析

为了解猪嵴病毒(PKV)的流行及变异情况,本研究根据PKV的3D基因保守区域核苷酸序列设计一对特异性引物,并利用RT-PCR方法对2012年来自24个省市84个猪场的病料样品共计236份进行3D基因的检测。结果显示:在236份病料中,共有63份为PKV阳性,阳性率为36.69%;而在检测的84个猪场中,共有36个猪场显示PKV阳性,猪场阳性率为42.85%。此外,对2012年分离的9个PKV部分3D基因进行测序分析,并与GenBank中登录的人、牛、猪以及鼠等嵴病毒株相关序列进行遗传变异分析。结果表明9个PKV 3D基因与国内外其他PKV株无论是在核苷酸水平上还是在氨基端水平上均具有较高的同源性,表明PKV的3D基因具有较高的保守性,可以作为病原检测的靶基因。

口蹄疫病毒3D基因在重组杆状病毒中的表达及检测

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒3D基因在Sf9细胞中的表达研究。首先克隆了3D基因片段,将pMD18_3D质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用EcoRⅠ及XbaⅠ酶切后,用T4DNA连接酶连接,构建了重组质粒pFastBac_3D;再将该重组质粒转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid_3D;将Bacmid_3D转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,并进行表达水平的检测。经SDS_PAGE和West ernblot检测,结果表明,3D蛋白在重组杆状病毒中获得表达。

猪捷申病毒3D蛋白的原核高效表达及其反应活性

根据猪捷申病毒(PTV)Swine/CH/IMH/03株核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以全长基因组重组质粒pSK-PTVFL为模板扩增了3D基因,并将扩增产物定向克隆到原核表达载体pET30a(+)中,阳性质粒转化BL21(DE3),阳性菌经0.3 mmol/L IPTG诱导后,进行Western-blotting检测。结果显示,3D蛋白获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白的66.1%,且重组蛋白能与PTV Swine/CH/IMH/03株阳性血清发生特异性反应。表明,3D蛋白能在大肠杆菌中高效表达,并具有良好的免疫原性,这为开发相应的鉴别诊断技术奠定了基础。

猪嵴病毒福建株3D基因的克隆及遗传进化分析

根据GenBank中登录的猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)3D基因序列特征设计特异性引物,采用RT-PCR方法从福建省某猪场采集腹泻粪便样品和小肠组织混合物中扩增猪嵴病毒3D基因,将扩增后的目的片段克隆后进行序列测定。结果表明,所扩增的目的片段编码有完整的3D开放阅读框,全长为1 407bp,编码有468个氨基酸。运用生物信息学软件,将获得3D基因序列和GenBank的猪嵴病毒株3D基因序列进行分析比较,该毒株的3D基因序列和SH-W-CHN/2010/China毒株的核苷酸同源性最高,为93.6%,与WH1株核苷酸同源性最低,为92%。从遗传进化上看,猪嵴病毒和其他中国株在遗传进化上处在一个同一分支,匈牙利分离株处在另一分支,表明猪嵴病毒可能在欧亚大陆上各自独立进化。

口蹄疫病毒3D基因的克隆及其编码蛋白的结构和功能预测

采用RT-PCR技术,对AsiaⅠ型口蹄疫病毒的3D基因进行克隆,并对其序列进行比对,同时利用Ex-pasy等生物软件对3D蛋白的二级、三级结构及生物学特性进行预测和分析.结果表明:3D蛋白在口蹄疫各血清型间高度保守,分子中含有一个糖基化位点及多个酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸位点,并存在一个单股正链RNA病毒依赖RNA多聚酶的催化区;结构特点显示3D蛋白为口蹄疫病毒复制所需的多聚酶.

口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因在毕赤酵母中的表达

以口蹄疫病毒 (Foot and mouthdiseasevirus ,FMDV)RNA聚合酶基因 3D为研究对象 ,对其部分碱基进行定点诱变 ,替换成在毕赤酵母 (Pichiapastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。改造后的目的片段用NotⅠ和AvrⅡ内切酶双酶切 ,然后与相应内切酶双酶切的穿梭载体pPIC9K相连接 ,构建重组表达载体 pPIC9K/ 3D ,转化大肠埃希氏菌JM 10 9,筛选阳性克隆pPIC9K/ 3D。经测序表明 ,插入位置、突变碱基、片段大小和读码框均正确。重组质粒用SacⅠ内切酶线化 ,电转化毕赤酵母SMD116 8,采用G4 18抗性梯度法筛选 ,获得高拷贝整合重组菌株SMD116 8/ pPIC9K/ 3DHIS+MUT+,利用甲醇进行诱导分泌表达 ,经SDS PAGE和Westernblot ting鉴定 ,3D基因在毕赤酵母中表达成功 ,目的蛋白分子质量大小为 5 2ku ,与预期的大小吻合 ,并能够被FMDV阳性血清所识别 ,表达量占总分泌蛋白量的 36 %。

口蹄疫病毒非结构蛋白3D原核表达、纯化和反应原性分析

采用RT-PCR技术扩增获得口蹄疫病毒(FMDV)细胞毒O/Akesu/58的非结构蛋白3D(NSP 3D)基因编码区,并定向克隆到pProexHTb原核表达载体上,再将重组pProex-3D转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达产物用亲和层析法纯化,经SDS-PAGE鉴定和Western-blot分析抗原性;以纯化的表达蛋白免疫豚鼠制备其多克隆抗体,ELISA测定抗体效价,间接免疫荧光法检测制备的豚鼠抗NSP 3D多克隆抗体与细胞毒天然抗原的反应原性.结果表明:表达的目的蛋白大小为53ku左右;ELISA结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶1 024以上;Western-blot分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应;间接免疫荧光检测发现,豚鼠抗3D蛋白多克隆抗体可与细胞毒天然抗原反应,与阴性对照未见反应.

猪嵴病毒441株3D基因的克隆及序列分析

根据GenBank中登录的猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)核苷酸序列设计引物,利用RT-PCR技术及3'RACE法扩增猪嵴病毒441株(swKoV CH441株)3D基因。成功扩增了swKoV CH441株的3D基因,3'非编码区(3'untranslated region,3'UTR)及Poly(A),扩增的基因片段长度分别为1 064、1 046和592 bp,包括3A、3B、3C、3D基因序列,3'UTR序列和一个至少含有29个Poly(A)的尾巴。序列分析结果表明,swKoV CH441株3D基因全长1 407 bp,编码468个氨基酸,分子质量约为53 369.29 D,理论等电点为6.12;3'UTR位于终止密码子TGA之后,长166 bp;swKoV CH441株与其他猪嵴病毒3D基因核苷酸序列相似性在92.2%-93.4%,氨基酸一致性为97.9%-99.4%。遗传进化分析表明,swKoV CH441株与国内株亲缘关系较近,与匈牙利株亲缘关系较远。

鸭甲型肝炎病毒-Ⅰ型3D基因在昆虫细胞中的表达及抗原检测

通过高保真PCR方法扩增出鸭甲型肝炎病毒-Ⅰ型(DHAV-Ⅰ)RNA依赖的RNA聚合酶3 D基因,克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1中,构建重组杆状病毒转移载体pFB-3D,将其转化感受态细胞DH10Bac,获得重组杆粒rBacmid-3D,转染昆虫细胞Sf9,收获重组杆状病毒rBac-3D,通过间接免疫荧光、Western blot对重组蛋白的表达水平进行检测。结果表明:间接免疫荧光数据显示表达的重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性结合,Western blot表达的重组蛋白分子量约为51ku,与理论值相符。这一研究说明3D蛋白在昆虫细胞中获得成功表达,为DHAV-Ⅰ型ELISA检测试剂盒的研制提供了技术基础。

口蹄疫病毒AF72株3D聚合酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒(FMDV)AF72株的3D聚合酶基因,并将其克隆至pGEM-T easy载体,测序分析结果表明,AF72 3D聚合酶基因与GenBank中公布的其他4个参考序列均具有较高的同源性。将目的基因插入原核表达载体pET-30a(+)中,构建了重组表达质粒pET-3D,鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,3D聚合酶基因在大肠杆菌中获得了正确表达,目的蛋白的分子量为46 ku。Western blot检测结果显示,表达产物可以与抗A型FMDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。

1型鸭甲型肝炎病毒3D基因的原核表达与多抗制备

根据血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)SH株3D基因序列设计并合成1对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增3D基因,将其克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为68 k D,Western blot分析显示该重组蛋白能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将切胶后纯化的目的蛋白免疫ICR小鼠,制备针对重组蛋白的多抗血清,Western blot结果显示制备的抗血清能够与DHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,3D基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于3D蛋白的检测,为3D蛋白的功能研究奠定了基础。

逆转录病毒载体介导的稳定表达口蹄疫病毒3D基因的BHK21细胞系的建立

【目的】研究口蹄疫病毒RNA聚合酶在BHK-21细胞中的稳定表达状况,为研究RNA聚合酶生物学活性及其基因工程疫苗研制提供科学依据。【方法】从重组质粒pMD18-T-3D扩增口蹄疫病毒3D基因,通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pBPSTR1-3D。用pBPSTR1-3D和pVSV-G双质粒瞬时转染GP2-293包装细胞,收获重组逆转录病毒,然后感染BHK-21细胞,嘌呤霉素持续筛选12d后获得阳性克隆,并用有限稀释法挑选单个阳性细胞克隆。【结果】应用PCR、RT-PCR技术可从体外反复传代的阳性细胞中扩增到3D基因,证实目的外源基因能转录并被稳定整合进宿主细胞基因组中。经SDS-PAGE、Westernblot、间接免疫荧光检测到在不同代次的阳性细胞中有目的蛋白表达。【结论】本试验利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术,将外源基因插入到靶细胞的基因组中,构建了稳定表达口蹄疫病毒RNA聚合酶的包装细胞系,为研究3D基因表达及其蛋白定位提供了方便,也为下一步研究RNA聚合酶生物学功能和疫苗研制提供了科学依据。

抗PAF单链抗体的基因构建及蛋白质3D模建

构建抗PAF单链抗体的基因并通过计算机模建分析几种不同连接类型的单链抗体空间结构差异 .采用重叠延伸PCR方法扩增了VH和VL基因 ,形成抗PAF的VH Linker VL (ScFv)基因产物 ,并经菌落PCR和测序分析鉴定 ,通过Internet对其 3D结构进行了模建与分析 .研究结果表明 :PCR产物电泳可见一条与目的基因大小一致的片段 ,经菌落PCR和测序分析鉴定 ,抗PAF单链抗体的基因构建成功 ;VH和VL在单链抗体中的顺序对单链抗体

携带I型鸭肝炎病毒3D基因的重组鸭瘟病毒的构建

为构建含有I型鸭病毒性肝炎病毒3D基因的重组鸭瘟病毒,本研究将已建立的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体(pBl ueSK-TK-EGFP)进行改造,在其荧光表达盒内插入I型鸭病毒性肝炎病毒3D基因,将重组后的转移载体(pBl ueSK-TK-EGFP-3D)转染已感染鸭瘟病毒的鸭胚成纤维细胞,转染细胞盲传2代后仍能观察到绿色荧光。表明本研究已成功构建携带I型鸭病毒性肝炎病毒3D基因的重组鸭瘟病载体(pBl ueSK-TK-EGFP-3D),此研究为研制鸭瘟-鸭肝炎二联苗奠定了基础。

番鸭1型病毒性肝炎病毒ZJX株分离鉴定及其3D基因序列分析

本研究从广东某养鸭场发病雏番鸭肝脏中分离到1株病毒。利用RT-PCR、基因序列分析、病毒中和试验及动物回归等鉴定为1型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-1)。3D基因序列分析显示,该毒株与2011年分离自黑龙江的1型DHV Du/CH/LGD/111238和Du/CH/LGD/111239分离株核苷酸同源性最高,达99.6%。分离株F3代尿囊液病毒价为105.5ELD50/0.2 mL,能够被DHV-1阳性血清中和。接种病料研磨上清的鸭胚在接种后3 d～5 d内全部死亡,胚体充血萎缩侏儒。该分离株人工感染3日龄雏番鸭表现为角弓反张和肝脏肿大出血等与临床病症。结果表明该分离株具有较强的致病性。

2013～2014年猪嵴病毒分子检测和3D基因遗传变异分析（英文）

[目的]为调查猪嵴病毒（PKV）在我国哺乳仔猪中的流行和变异情况。[方法]采集2013~2014年我国5个省份27个猪场224份哺乳仔猪腹泻粪样,采用RT-PCR方法对PKV的3D基因进行检测,并对其中的29个PKV3D基因进行序列测定和遗传变异分析。[结果]腹泻粪样中PKV总阳性率为65.18%（146/224）,猪场PKV总阳性率为85.2%（23/27）;29个PKV3D基因与国内外6株其他PKV株相关序列的核苷酸同源性为87.0%~100%,所推导的氨基酸序列同源性为92.7%~100%。[结论]我国哺乳仔猪中普遍存在PKV感染,PKV 3D基因呈现多样性。

B细胞趋化因子对CVB3融合基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1免疫效果的影响

目的:探讨B细胞趋化因子(B-lymphocyte chemoattractant,BLC)对柯萨奇病毒B3融合基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1免疫效果的影响。方法:将BALB/c小鼠随机分为4组,分别肌肉注射pcDNA3、pcDNA3/BLC、pcDNA3/C3d3-sVP1和含pcDNA3/BLC与pcDNA3/C3d3-sVP1的混合质粒,于免疫后不同时间检测小鼠血清的中和抗体滴度、特异性CTL杀伤活性;以LD50的CVB3病毒液感染已免疫小鼠,检测小鼠血中病毒滴度,观察存活情况以评价各种疫苗的免疫保护作用。结果:小鼠的中和抗体滴度随免疫次数增加而提高,混合组中和抗体滴度(42.17±1.43)和特异性CTL杀伤率(41.3%±3.51%)均明显高于pcDNA3/C3d3-sVP1组(P<0.05),而血中病毒滴度低于pcDNA3/C3d3-sVP1组;经致死量CVB3感染后,pcDNA3/BLC和pcDNA3/C3d3-sVP1混合免疫的小鼠生存率达44%,生存率高于其他各组。结论:BLC可显著提高C3d3-sVP1基因诱导的特异性免疫应答,增强基因疫苗对机体的免疫保护作用。

猪脑心肌炎病毒GXLC株的分离及其3D基因分子特征的分析

采集临床疑似脑心肌炎死亡仔猪的组织作为接种材料,接种于BHK-21细胞系,观察细胞病变（CPE）,并用RT-PCR和间接荧光抗体试验（IFA）进行鉴定,证实分离到1株脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）,命名为GXLC株。应用RT-PCR方法扩增GXLC株的3D基因,扩增产物克隆入pMD18-T载体后进行测序,对获得的3D基因序列进行分析。序列分析结果表明,GXLC株3D基因全长1380 nt,编码460个氨基酸,含有7个抗原表位。同源性分析结果表明,GXLC株与国内外其它EMCV分离株3D基因核苷酸序列的同源性在84.7%~99.7%之间,氨基酸序列的同源性在96.1%~99.6%之间。遗传进化分析结果表明,基于3D基因核苷酸序列绘制的系统进化树可将所有EMCV分离株分成2个群：Ⅰ群和Ⅱ群,Ⅰ群可再细分为Ⅰa亚群和Ⅰb亚群,其中猪源EMCV在Ⅰ群和Ⅱ群中均有分布,而鼠源EMCV分布在Ⅰ群,人源EMCV分布在Ⅱ群;GXLC株与其它中国分离株均属于Ⅰa亚群。