本地毛形线虫49 Ku ES蛋白结构基因的分子克隆及原核表达

提取Trichinella nativa(T.nativa)肌幼虫的总RNA,用RT-PCR方法扩增出了编码T.nativa 49 Ku ES蛋白的结构基因。基因克隆后测序,序列测定结果表明:目的基因TNPG长度为951 bp,核苷酸序列同已发表的Trichinella spiralis(T.spiralis)相应的序列P49同源性为97.68%,所推导的氨基酸序列同源性为95.24%。将目的基因TNPG插入到原核表达载体pET-30a的BamHⅠ酶切位点处,并转化到感受态表达菌中进行诱导表达。结果显示TNPG在原核表达菌BL-21中获得了高效表达,表达产物为40.8 Ku的融合蛋白,表达量达到菌体总蛋白的22.8%。通过Western blot分析,表达产物可以被小鼠T.nativa和T.spiralis阳性血清以及它们的中国地理株的小鼠血清特异性识别。

本地毛形线虫49ku ES重组蛋白诱发小鼠保护性免疫的研究

目的研究本地毛形线虫肌幼虫49ku ES重组蛋白对小鼠的免疫保护作用。方法以表达的本地毛形线虫肌幼虫49ku ES重组蛋白免疫小鼠,共免疫3次。末次免疫后10d,每只小鼠攻击感染200条本地毛形线虫感染性肌幼虫,检测本地毛形线虫7日龄成虫数、雌虫体外产新生幼虫数以及感染35d肌幼虫数,并且计算减虫率,应用自制的ELISA方法测定各组小鼠血清抗体OD值。结果成虫减虫率、新生幼虫减虫率、肌幼虫减虫率分别为9.4%、70.2%和71.3%,免疫组血清抗体水平远远高于佐剂对照组和感染对照组(P<0.01)。结论本地毛形线虫肌幼虫49ku ES重组蛋白诱导小鼠产生较好的抗本地毛形线虫的保护性免疫。

本地毛形线虫49kuES蛋白结构基因在昆虫细胞中的表达

根据BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统的供体质粒,设计表达引物,从克隆质粒上扩增本地毛形线虫(Trichinella nativa)49kuES结构蛋白基因TNPG,酶切后与供体质粒连接,在大肠杆菌中克隆,将克隆有外源基因的供体质粒转化DH10Bac感受态菌,该菌含有杆状病毒穿梭载体,供体质粒中的外源基因在辅助质粒编码的转座酶作用下,通过转座而插入杆状病毒基因组中,筛选含有重组质粒的Bacmid DNA,用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒。SDS-PAGE电泳显示表达蛋白为36ku的融合蛋白,Western blot检测表明表达的融合蛋白能够被小鼠旋毛虫的阳性血清识别。实验结果表明,本地毛形线虫的ES融合蛋白的制备将在诊断方法的建立和免疫研究方面具有很好的应用前景。