FPV 4b核心蛋白基因的克隆及其探针制备

利用PCR方法成功克隆了FPV 4b核心蛋白基因1 361 bp片段。序列分析表明:该序列与模板DNA(AF198100)的碱基序列同源性为99.5%,只有7个碱基差异(第215位C→A,第386位T→A,第388位G→A,第1 014位T→G,第1 034位T→G,第1 137位C→T,第1 143位A→G)。回收FPV 4b核心蛋白基因1 361 bp片段与pMD18-T载体相连构建重组质粒pMD18-T-4b,用EcoRⅠ酶切pMD18-T-4b后得到1个约360 bp大小的DNA片段,以其为模板制备了地高辛标记的DNA探针。对新标记的探针进行标记效率检测,结果显示其标记效率为100 mg/L。敏感性检测表明,该探针对同源DNA的检出限量为10 pg。特异性检测结果表明,用本试验所标记的探针对提取的FPV 282E4和FPV JL株DNA、重组质粒pMD 18-T-4b进行检测结果均呈阳性,而鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、CEF的核酸提取物均呈阴性,说明该探针具有较强的特异性。

鸡痘病毒基因探针检测方法的建立及初步应用

利用PCR方法成功克隆了鸡痘病毒(Fowl poxvirus,FPV)4b核心蛋白基因549bp片段,序列分析表明,该序列与模板DNA(AF198100)碱基序列的同源性为99.45%,只有3个碱基差异,第215位由C→T,第386位由T→A,第388位由G→A。回收FPV 4b核心蛋白基因549bp片段,以其为模板制备了地高辛标记的DNA探针。对新标记的探针进行标记效率检测,结果显示其标记效率为100mg/L;敏感性检测表明,该探针对同源DNA的检出限量为10pg;特异性检测结果表明,用本试验所标记的探针对提取的FPV 282E4和FPV JL株DNA、重组质粒pMD18-T-4b进行检测结果均呈阳性,而鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、CEF的核酸提取物均成阴性,说明该探针具有较强的特异性。初步应用表明,本试验所建立的FPV的基因探针检测法可用于FPV的检测。