利用5′锚定PCR技术分离枇杷微卫星标记

用5′锚定PCR技术分离出32个枇杷特异SSR位点,对其中适合设计引物的28个位点设计了相应的引物,并分别与对应的5′锚定的简并SSR引物配对,应用于5个枇杷品种的基因组PCR扩增。结果表明,27条引物在5个受试枇杷品种中有扩增产物,其中24条为可用引物,另外3条引物因为扩增产物不符合SSR标记的特征不能用作SSR标记的引物。

基于锚定PCR技术对10种重要农业害虫微卫星DNA位点的筛选及其特征分析

微卫星DNA广泛存在于真核和原核生物的基因组中，具有多态性丰富、易于检测等特点，在遗传图谱的构建、动植物遗传学育种等方面被广泛应用。利用5′锚定PCR技术对桃小食心虫、桃蛀螟、玉米螟、二点委夜蛾、花蓟马、黄胸蓟马、棕榈蓟马、斑翅果蝇、稻水象甲、扶桑绵粉蚧10种重要农业害虫进行微卫星DNA筛选，并分析各个物种的微卫星DNA的特点。不同物种的阳性克隆率、微卫星比率、克隆效率和冗余率存在不同程度的差异；在核苷酸碱基数目上，主要为二核苷酸重复序列，占重复位点总数的93．2％～100％，三、四核苷酸重复位点较少。在二核苷酸重复位点中， CA/TG重复位点最为丰富，占重复位点总数的89．2％～100％。这与使用的锚定引物密切相关；10种害虫的微卫星DNA平均重复次数为6．7～8．9次，其中玉米螟具有最高的微卫星DNA重复次数（34次）；在序列类型上，完全型序列占上述害虫序列总数的91．0％～100％。5′锚定PCR技术能够快速挖掘害虫的微卫星DNA位点，本研究结果为这些害虫微卫星位点的进一步利用奠定了基础。

油田硫酸盐还原菌APS-MPN-PCR快速定量检测方法

为了解决现有油田污水中硫酸盐还原菌检测周期长、检测费用较高的问题，应用聚合酶链式反应（PCR）技术与倍比稀释法（MPN）相结合的APS-MPN-PCR法，对硫酸盐还原菌进行快速定量检测．从污水中制备了直接用于PCR扩增的菌液，保证了定量检测的准确性；建立以腺苷酰硫酸还原酶基因（APS）为靶位点的通用探针APS7F和APS8R的反应体系和扩增条件．研究结果表明，与液体稀释培养法相比，该方法检测灵敏度提高了两个数量级，操作时间缩短（整个检测过程只需要3～4h），检测费用也降低．该方法检测结果非常稳定，真实的表征了污水中实际的SRB菌数量，可以在生产中应用．

牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

持续性感染和免疫耐受是牛病毒性腹泻病的重要特征,这一特征给该病的诊断、检疫及防控造成很大困难,为此,建立快速实用、高效敏感的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)检测方法具有重要意义。据GenBank中登录的BVDV 5′UTR保守区域设计并合成1对特异性引物,以SYBR GreenⅠ染料为扩增指示剂,建立了BVDV实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异、重复性好等优点。该方法的建立为牛病毒性腹泻病的早期快速诊断和有效检出持续性感染动物提供了手段,是该病检疫和诊断方法的补充和完善。

实时荧光定量PCR技术的优化及其在恙虫病东方体诊断中的应用

目的建立一种优化的实时荧光定量PCR技术,并用于诊断粤北山区恙虫病东方体(Ot)基因型。方法采用优化实时荧光定量PCR技术对感染Ot的患者和鼠类的血液和组织标本检测Ot DNA载量并分析其基因型,并与未优化实时荧光定量PCR和巢式PCR的检测结果进行比较。结果采用优化实时荧光定量PCR技术检测660例发热患者,有224例检测到Ot,其中108例是发热5d内的早期患恙虫病患者,以及在55份鼠类的标本中有12份能检测到感染Ot,均为Gilliam型;未优化实时荧光定量PCR在患病7d以上才能检测到Ot。同时,在鼠类基因扩增片段还显示出与Gilliam、Karp、Kato3株国际参考株不同,经巢式PCR分型证实为Kawasaki型,与巢式PCR基因分型的结果相符。结论优化实时荧光定量PCR技术可作为早期诊断恙虫病的实验方法,用于快速分析Ot基因型,适合在基层医院推广应用。

我院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌碳青霉烯酶不同检测方法的比较

目的探讨评价碳青霉烯酶的不同检测方法,为实验室检测及临床诊疗提供依据。方法选用EDTA碳青霉烯灭活方法(mCIM/eCIM)检测耐碳青霉烯类肠杆菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)菌株耐药表型,以两种免疫层析碳青霉烯酶检测试剂盒、荧光定量PCR法检测CRE菌株基因型。统计学方法采用Kappa一致性检验,比较各种检测方法的临床可操作性。结果经荧光定量PCR扩增后基因测序显示73株肺炎克雷伯菌中71株携带KPC基因,2株携带NDM基因;7株大肠埃希菌中6株携带NDM基因,1株携带KPC基因;mCIM联合eCIM检测KPC的灵敏度为68.1%(49/72),检测NDM的灵敏度为100.0%(8/8);NG-test Carba 5和免疫显色试剂盒检测KPC和NDM灵敏度为100.0%、特异性为100.0%。结论NG-test Carba 5和免疫显色试剂盒检测可以成为检测我国最常见碳青霉烯酶的快速、方便的诊断工具,从而有助于控制产碳青霉烯酶的分离株在医院间的传播,为院感防控工作起到至关重要的意义。

基于5’锚定PCR法和磁珠富集法的西藏沙棘多态性SSR引物开发

简单序列重复（SSR）是共显性遗传标记,可有效地反映个体遗传信息和亲缘关系,在杂交检测、物种鉴定及种群遗传学研究等方面应用广泛.作为重要的经济植物,西藏沙棘是青藏高原植物生态适应与进化研究的极佳材料,但目前还缺乏对其种质资源和遗传结构的了解.利用5’锚定PCR方法和磁珠富集法开发西藏沙棘的SSR引物.共得到13个种内多态性的SSR位点,分别有2~4个等位基因,观测杂合度（HO）从0.00到0.74不等,预期杂合度（HE）从0.04到0.54不等.两种方法所得到的引物可用于西藏沙棘的种质资源鉴定、遗传结构研究等多个方面.

骆驼β-防御素caBD-1 cDNA基因全序列RACE扩增方法的建立

为获得骆驼β-防御素基因(caBD-1 cDNA)的全长序列,采用锚定PCR RACE技术,根据已获得的骆驼β-防御素基因的部分已知序列,设计了1条特异性引物作为上游引物,将反转录引物中的部分序列即3′接合器引物作为下游引物,成功地克隆了caBD-1 cDNA的3′末端序列;采用反向嵌套PCR RACE技术,根据已获得的骆驼β-防御素cDNA的部分序列,设计了1条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功地克隆了骆驼β-防御素caBD-1cDNA的5′末端序列。结果显示,获得了骆驼β-防御素caBD-1 cDNA基因的全序列。证实,RACE技术用于防御素基因的扩增是可行的。

磁珠富集法与5'锚定PCR法开发背瘤丽蚌微卫星标记的比较

利用磁珠富集法和5'锚定PCR法开发背瘤丽蚌的微卫星标记,将获得的多态性引物用于群体的遗传多态性分析,以期在比较两种开发微卫星标记方法的基础上同时获得一批有用的微卫星引物。从磁珠富集法获得的微卫星序列阳性克隆率为69.2%,重复次数超过10的占总数的70.2%,从设计的28对引物中筛选得到多态性引物11对,开发效率为39.3%。这11对引物用于养殖群体的遗传多样性分析,结果显示,等位基因数范围为4～13,观测杂合度、期望杂合度范围分别为0.205～0.738、0.566～0.839。而5'锚定PCR法获得的微卫星序列阳性克隆率为97.8%,重复次数超过10的占总数的24.7%,从设计的56对引物中筛选得到多态性引物19对,开发效率为30.4%。这19对引物用于养殖群体的遗传多样性分析,结果显示,等位基因数范围为3～10,观测杂合度、期望杂合度范围分别为0.208～0.894、0.431～0.896。实验结果表明,磁珠富集法所获微卫星序列质量高,开发微卫星标记效率较高;而5'锚定PCR法实验操作更简便,所获得的引物遗传多样性指数更高。两种方法开发的引物均可用于背瘤丽蚌和近缘种的野生种质资源遗传多样性研究。

关节镜下非打结型与打结型缝合锚钉Bankart重建治疗复发性肩关节前向不稳

目的探讨关节镜下非打结型与打结型缝合锚钉对复发性肩关节前向不稳Bankart损伤的临床效果。方法回顾性分析2006年3月至2009年1月广州军区广州总医院收治的44例复发性肩关节脱位Bankart损伤患者的临床资料,根据关节镜下修复方式的不同分为非打结组(可吸收非打结型缝合锚钉修复,20例)和打结组(打结型缝合锚钉修复,24例)。采用美国肩肘外科医师(ASES)评分及Constant-Murley功能评分对患者术前、末次随访时肩关节功能进行评估,记录肩关节活动范围,观察并发症发生情况。结果所有患者获得随访,随访时间20～46个月,平均随访时间30个月。非打结组术前和终末随访时肩关节前屈上举角度、外展90°时外旋角度分别为(163±9)°和(170±4)°、(58±14)°和(90±6)°,术后外展90°时患侧外旋角度较健侧受限(8±6)°;术前和终末随访时ASES评分、Constant-Murley评分分别为(77.4±3.7)分和(94.3±2.6)分、(78.1±4.6)分和(93.9±3.7)分,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。打结组术前和终末随访时肩关节前屈上举角度、外展90°时外旋角度分别为(162±8)°和(170±6)°、(61±13)°和(91±6)°,术后外展90°时患侧外旋角度较健侧受限(5±3)°;术前和终末随访时ASES评分、Constant-Murley评分分别为(75.8±2.9)分和(95.1±3.7)分、(76.2±5.9)分和(92.8±5.2)分,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。两组间术前、术后各项指标比较,差异无统计学意义(P>0.05)。患者均未出现术后再脱位,均重返伤前工作岗位。结论肩关节镜下Bankart重建手术是治疗复发性肩关节前向不稳的有效方法,非打结型和打结型缝合锚钉修复Bankart损伤疗效相似。

牛匈爱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

水牛匈爱病毒(BufHuV)是2021年在广西水牛中新发现的一种小核糖核酸病毒,本研究旨在建立一种可用于临床快速且特异检测牛匈爱病毒的方法。基于GenBank上公布的bovine hunnivirus、ovine hunnivirus和BufHuV的5′UTR保守区设计了1对特异性引物,首次建立了检测牛匈爱病毒的SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果表明,标准曲线在1.1×10^(8)copies/μL~1.1×10^(3)copies/μL质粒标准品稀释浓度范围内呈线性关系,斜率为-3.2657,相关系数为0.9998,熔解曲线为单峰,检测下限为1.1×10^(1)copies/μL,比常规PCR敏感性高100倍;特异性高,与多种常见的牛病病毒均无交叉反应;重复性好,批内和批间变异系数均小于1.0%。收集了257份有腹泻迹象的牛粪样品,用于对所建立平台的性能评估,结果,建立的实时荧光定量PCR的阳性检出率为3.89%,高于普通PCR的阳性检出率(1.56%)。上述结果表明,该方法将为牛匈爱病毒的临床样品检测、流行病学监测提供一种快速、可靠、低成本的替代方案,也为后续研究奠定了基础。