抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性定量PCR检测方法的建立及其标准化

【目的】抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5已获得中国进口加工原料安全证书,建立一种特异、准确、灵敏的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,为抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5在中国的安全监管提供精准测量技术。【方法】首先利用Beacon designer 8.0软件对抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体5′端旁侧序列设计18对引物探针,结合1对罗萨里奥农业生物技术学院公司提供的引物探针,随后采用qPCR技术对引物探针进行特异性筛选,遴选出1对候选引物探针;设置实时荧光定量PCR的引物/探针浓度梯度,优化qPCR方法的反应体系;设置不同类型的特异性测试样品测试方法的特异性;以纯合抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5基因组DNA作为标准样品,梯度稀释成标准溶液模板,绘制标准曲线,考察qPCR方法的线性动态范围,配置拷贝数比值为5%、1%和0.1%的测试样品,评价定量方法的准确性;配置拷贝数比值为0.05%和0.025%的样品,测试方法的检出限;拷贝数比值为0.1%的样品经16次定量测试,确定方法的定量限;最终确定抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法的关键技术参数。8家有资质单位对该定量PCR方法的特异性、检出限、定量限、准确性等进行验证,采用柯克伦法和格拉布斯法评估qPCR方法的重复性和再现性,利用线性最小二乘法对准确性样品测试结果的测量不确定度进行预评定。【结果】通过特异性筛查确定RBORD-F1/RBORD-R1/RBORD-P1引物探针为候选组合,建立了抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性qPCR方法,扩增片段为138 bp,优化的反应体系引物终浓度为0.4μmol·L-1、探针终浓度为0.2μmol·L-1;IND-ØØ41Ø-5和Lectin标准曲线的线性动力学范围为33—83190 copies的基因组DNA,该方法可准确定量5%、1%和0.1%含量的IND-ØØ41Ø-5测试样品,偏差和相对标准偏差(RSD)均小于25%;确定检出限为0.05%、定量限为0.1%。8家实验室间联合验证该方法稳定性好、特异性强,检出限为0.05%,定量限为0.1%,且具备良好的实验室间重复性和再现性,经测量不确定度预评定后,获得5份抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5测试样品的测量结果分别为(0.10±0.02)%、(0.53±0.09)%、(1.05±0.18)%、(2.05±0.34)%和(5.18±0.87)%,结果准确可靠。【结论】成功建立了抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法,能够实现抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体成分的精准定量检测。

微小RNA-199a-5p保护大鼠脑缺血后血-脑屏障完整性

目的探讨微小RNA(miR)-199a-5p保护脑缺血后血-脑屏障(BBB)完整性的机制。方法通过SPF级成年雄性SD大鼠建立永久性大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,48只大鼠随机分为假手术组、模型组、MCAO+miR-199a-5p组和MCAO+miR-199a-5p阴性对照组,每组12只。应用Ludmila Belayev 12分评分法评估大鼠的神经行为学表现;采用Evans蓝染色检测脑缺血后BBB的完整性;免疫荧光染色检测脑缺血后细胞凋亡;Western blotting技术检测claudin-5、磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基2(PIK3R2)、p-Akt、Akt和血管内皮生长因子(VEGF)-A的蛋白表达;利用Real-time PCR检测脑缺血半暗带、梗死区miR-199a-5p、claudin-5及VEGF-A表达水平。结果MiR-199a-5p mimic干预增强MCAO大鼠本体感觉和运动能力。MiR-199a-5p降低脑缺血后PIK3R2的表达,激活Akt信号通路,并增加缺血半暗带中claudin-5和VEGF-A的表达。此外,miR-199a-5p减轻了脑缺血后的炎症。MiR-199a-5p降低脑缺血后BBB渗透性,减少神经细胞凋亡。结论MiR-199a-5p可降低缺血性脑卒中后PIK3R2的表达,激活Akt信号通路,降低炎性细胞因子的表达,减轻缺血性脑卒中对BBB的破坏。

miR-654-5p与ATM蛋白在食管癌中的表达及临床意义

目的:探讨miR-654-5p与共济失调性毛细血管扩张症突变(ATM)蛋白在食管癌组织与癌旁切缘正常鳞状上皮组织中的表达及两者在食管癌发生中的作用及相关性。方法:采用荧光定量PCR检测miR-654-5p在186例食管癌及其癌旁正常食管黏膜组织中的表达;采用免疫组化SP法检测ATM蛋白在186例食管癌及其癌旁正常食管黏膜组织中的表达。结果:通过分析186例食管癌患者的临床病理特征,发现miR-654-5p在食管癌组织中高表达率,随着分化程度的降低、浸润深度的加深其高表达率增高;ATM蛋白阳性表达率随着分化程度的降低、浸润深度的加深而降低。两者在食管癌中表达与性别、年龄、肿块大小、肿块部位无相关性(P>0.05)。结论:miR-654-5p和ATM蛋白的表达与食管癌分化程度、浸润深度有关(P<0.05),两者在食管癌中的表达趋势相反(P=0.014),显示两者在食管癌的发生发展中有一定作用,且可能共同作用于食管癌的发生。

基于改进YOLOv5的无人机遥感图像检测算法探究

为了提高YOLOv5模型对无人机遥感图像的检测性能,本文进行了研究,该模型的主要问题是对小目标的漏检率和误检率较高。通过理论分析,发现其Anchor机制具有一定的优化空间,改进策略为使用NWD损失函数代替IoU损失函数。在性能仿真阶段,对比了4种基准模型的特点,将YOLOv5s模型与改进后的模型进行对比,对无人机遥感图像进行检测。结果显示,改进后的YOLOv5模型在准确度、召回率、多类别平均精确度方面均优于改进前。

利用5′锚定PCR技术分离枇杷微卫星标记

用5′锚定PCR技术分离出32个枇杷特异SSR位点,对其中适合设计引物的28个位点设计了相应的引物,并分别与对应的5′锚定的简并SSR引物配对,应用于5个枇杷品种的基因组PCR扩增。结果表明,27条引物在5个受试枇杷品种中有扩增产物,其中24条为可用引物,另外3条引物因为扩增产物不符合SSR标记的特征不能用作SSR标记的引物。

利用多重PCR反应同时筛选番茄Ty-1和cf-5基因

利用同一PCR反应体系同时扩增、筛选分别与番茄抗黄化曲叶病毒病的Ty-1基因和番茄抗叶霉病的cf-5基因紧密连锁的SCAR标记,扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合。与Ty-1基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记,抗感材料均产生398bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在TaqI酶切位点,酶切后分别产生了303bp和95bp以及398、303bp和95bp的特异性片段,而感病基因型无此酶切位点,酶切后仍呈现398bp的特异带。与cf-5基因紧密连锁的SCAR2标记扩增后抗感材料均产生960bp的特异片段,用限制性内切酶TaqI酶切后,含cf-5基因的材料产生一条256bp的特异带,而不含cf-5基因的材料产生一条225bp的特异带。

微滴式数字PCR定量检测转基因玉米品系VCO-01981-5

建立基于QX100微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)平台的我国未批准转基因玉米品系VCO-01981-5的二重微滴式数字PCR定量检测方法。该方法选择基因组中单拷贝的玉米内源基因hmg和VCO-01981-5品系边界序列为定量靶序列,分别设计不同的PCR扩增引物和TaqMan探针,并对两种探针用不同的荧光进行标记,然后将上述探针和引物置于同一个PCR反应体系中以同时定量两个靶标序列。特异性实验结果显示该法只有VCO-01981-5品系的两个靶序列才都有扩增信号。灵敏度、线性和准确性实验结果显示在定量结果相对标准偏差不大于25%时,最低可稳定定量5个拷贝的VCO-01981-5品系特异性序列分子和4个拷贝的内源基因hmg分子;而在高达50 ng模板DNA以下范围内,PCR反应模板量与测定样品拷贝数之间呈高度正相关,相关系数达0.99以上;平均误差小于10%。结果表明本研究建立的该玉米品系定量方法特异性强,稳定性好,精确性、准确性以及灵敏度高,定量范围广,可用于进、出口农产品和食品中该转基因玉米品系成分的定量检测。此外,该法还可为其他转基因玉米品系及其他转基因作物品系建立类似定量检测方法提供参考。

反向嵌套PCR法高效扩增辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA5′末端序列

采用反向嵌套PCR法 ,根据已获得的辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA的部分序列 ,设计一条 5′末端磷酸化的特异性反转录引物和两对特异性反向嵌套PCR引物 ,成功地克隆了辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA 5′末端。与锚定PCR法相比 ,反向嵌套PCR法具有特异性强、扩增效率高等优点 ,是一种非常有效的扩增cDNA 5′末端序列的方法。

基于PMA-qPCR检测青枯菌5号生理小种活菌的方法

青枯菌5号生理小种(Ralstonia solanacearum race 5)是引发桑青枯病的病原菌。为了改进常规PCR方法不能对活体病原菌进行准确鉴别和定量分析的不足,建立叠氮溴化丙锭(PMA)预处理结合荧光定量PCR(q PCR)检测青枯菌5号生理小种活菌的方法。该方法首先将待检测样品的病原菌细胞用质量浓度为15 ng/μL的PMA暗孵育10 min后,在卤钨灯下曝光5min,以消除死菌细胞DNA的PCR扩增信号。用PMA-q PCR方法对含青枯菌5号生理小种活菌和死菌的混合样本的检测结果表明,死菌的存在不会对活菌细胞DNA的扩增产生影响。建立的PMA-q PCR标准曲线显示,在菌液浓度为103~107CFU/m L的范围内,qPCR循环阈值(Ct)与菌液浓度的对数值之间呈良好的线性关系,线性方程为y=-3.477x+47.489,R^2=0.997。建立的PMA-q PCR方法能更为准确地检测复杂样本中的青枯菌5号生理小种活菌数量,有助于对桑树青枯病的早期诊断和及时制定病害防控措施。

猴副流感病毒SV5 PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立检测SV5的PCR方法并加以初步应用。方法根据GenBank中报道的SV5序列,针对其中的SH基因设计引物进行PCR反应,扩增产物进行测序并用BLAST软件进行同源性比对,同时利用限制性内切酶的酶切反应以证实此PCR反应的特异性。在此基础上设计巢式PCR提高此方法的灵敏度。利用此方法对20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本进行检测。结果利用设计的引物扩增出的序列测序结果证实与报道的SV5SH基因相对位置的序列一致。AccⅢ限制性内切酶可对PCR产物进行特异性酶切。巢式PCR比一次PCR的敏感度有所提高。用此方法检测的20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本结果为阴性。结论初步建立了检测SV5病毒的PCR方法,排除实验室用20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本SV5的污染。

禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为了对致病性强、危害性大的H5、H7、H9亚型禽流感病毒进行同时集成化快速检测,通过对GenBank已报道的禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了H5、H7、H9 3个亚型的特异性引物和分别用3个荧光基团标记的Taqman MGB核酸探针。将各个亚型引物与探针优化组合,筛选出能够同时检测禽流感病毒H5、H7、H9 3个亚型、且对Ct值和扩增效率影响不大的3组引物和探针,建立了三重实时荧光RT-PCR方法。该方法特异性好,在我们检测的样品中,没有发现假阳性和假阴性现象。同时敏感性高,检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型的敏感性分别达到1 0001、000、500个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对禽流感H5、H7、H9 3个亚型的不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测3个病毒亚型。所建立的方法对保存的89个禽流感病毒样品进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定、HA、HI)的符合率达100%。用上述建立的方法与鸡胚分离法同时对新鲜采集的4 000多份临床样品进行检测,两种方法的检测结果符合率为100%。

实时PCR分析△^5脱饱和酶在花生四烯酸合成中的作用

花生四烯酸是人体的必需脂肪酸，具有独特的生物活性。△^5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径中催化二高-γ-亚麻酸脱饱和为花生四烯酸的酶。通过实时定量PCR技术，检测了△^5脱饱和酶在不同花生四烯酸产量的高山被孢霉（Mortierella alpina）菌株M10、M6和M23中的mRNA表达水平，以及在高产花生四烯酸菌株M6培养过程中的mRNA表达水平的动态变化。发现岔脱饱和酶基因的mRNA表达水平与花生四烯酸的产生之间存在明显的线性关系，表明△^5脱饱和酶在高山被孢霉花生四烯酸合成途径中起到了非常重要的作用。

高分子量麦谷蛋白亚基基因Dx5的PCR检测

为 Dx5基因设计了 1对特异引物 ,选用 HMW- GS在 Glu Dx1位点已知的 2 2个材料对其进行了验证。结果表明 ,该引物的准确率达到 10 0 %,完全可以作为 Dx5基因的检测引物。利用这 1对引物 ,通过 PCR技术对 4 0种材料的 Dx5基因进行了检测 ,发现仅有 986 0 5 ,陕 2 5 3,郑州 891,97- 2 14 3,绵阳 96 171- 10 ,绵阳 19,中 1813- 1和绵阳 11等 8个品种 (系 )携带 Dx5基因 ,占待测材料总数的 2 0 .0 %,远远低于北美小麦品种中 Dx5基因的携带率。研究中还发现 ,对检测优质面包烘烤品质基因而言 ,PCR方法是最简便、快速、准确的方法之一。

转基因玉米2A-5特异性PCR方法的建立

根据转基因玉米2A-5的旁侧序列信息,设计并筛选出最佳特异性引物及Taqman探针组合2A-5-5-QF8、2A-5-5-QR8、2A-5-5-QP8,优化了该引物探针组合的反应体系,建立了转基因玉米2A-5转化体特异性PCR检测方法。将特异性引物及Taqman探针组合用于qRT-PCR和ddPCR技术,研究了转基因玉米2A-5转化体的定量检测方法,发现PCR定量检测转基因含量与测定样品转基因含量之间呈高度正相关。研究获得的转基因玉米2A-5转化体特异性PCR检测方法及定量qRT-PCR、ddPCR检测方法具有较高的特异性、准确性和灵敏度,是今后准确、高效检测2A-5及其产品的有效方法之一,同时也为我国转基因生物安全监管提供了良好的技术支撑。

5-HT受体亚型mRNAs在大鼠三叉神经节和脊髓背根节的表达——PCR法研究

根据 5- HT受体 13种亚型互补 DNA序列合成相应的特异性引物 ,用 PCR方法对各种 5- HT受体亚型在大鼠三叉神经节及脊髓背根节的表达进行了观察。结果显示 :三叉神经节表达 5- HT1A、5- HT1B、5- HT1D、5- HT2 A、5- HT3、5- HT4 和 5- HT7亚型。背根节表达的 5- HT受体亚型与三叉神经节者相同 ,但这些亚型的电泳条带密度在两种神经节存在着差异。三叉节的 5- HT1D和 5- HT3电泳条带密度最高 ,5- HT1A和 5- HT4 次之 ,5- HT1B、5- HT2 A和 5- HT7较弱 ;背根节的 5- HT3和 5- HT1D电泳条带密度最强 ,5- HT1B和 5- HT2 A次之 ,而 5-HT1A、5- HT4 和 5- HT7则较弱。将各亚型的 PCR阳性产物进一步克隆至 p CR 载体进行序列测定 ,结果表明这些 PCR产物的 DNA序列与已知的各亚型的序列一致。本研究的结果对进一步探讨 5-

杂交方法获得的拟南芥蔗糖转运蛋白基因SUC3/SUC5双突变体及其PCR鉴定

文章以拟南芥T-DNA插入纯合突变体atsuc3和atsuc5为亲本,采用传统杂交技术与PCR鉴定相结合的方法获得了atsuc3/atsuc5纯合双突变体。

高致病性禽流感通用和H5亚型荧光定量PCR方法的建立

目的:建立高致病性禽流感H5亚型荧光定量PCR方法.方法:根据禽流感病毒(AIV)M基因和H5-HA基因分别设计AIV通用和H5亚型特异荧光定量PCR引物和探针,优化反应体系和反应条件,分析该试剂的敏感性、特异性、重复性等.结果:经优化反应体系和反应条件后,AIV通用试剂和AIV-H5试剂的敏感性达到1×101.25EID50水平;与细胞培养比较,AIV-H5试剂Kappa吻合系数κ为0.991(P<0.01),统计学显示两种检测结果的吻合度很强;批内和批间精密度CT值的CV值均远小于10%,可重复性良好.结论:本项目研制的AIV通用试剂和AIV-H5试剂的敏感性、特异性、重复性均好,适合在禽流感疫情和疑似H5禽流感病例中检测使用.

猴副流感病毒5型实时荧光定量PCR方法的建立与初步应用

目的建立猴副流感病毒5型（SV5）实时荧光定量PCR方法，并初步应用于猴样本检测。方法根据SV5病毒NP基因保守片段设计特异引物和TaqMan探针，使用分子生物学方法制备质粒标准品，建立SV5实时荧光定量PCR方法；对该方法的线性、敏感性、特异性及稳定性进行测定；并使用该方法对24个猴样品进行检测。结果成功建立SV5实时荧光定量PCR方法；该方法线性范围为（6．8×10^9～6．8×10^5）copy／μL，灵敏度为6．8copy／μL，批内变异系数（CV）为0．63％～8．71％，批间CV为1．52％-12．38％，而且方法特异性好；在24个猴肺样品中未检测出阳性。结论该方法的建立为实验动物和动物源性生物制品中SV5的定量检测奠定了基础。

免疫PCR检测微量H5亚型禽流感病毒

为了有效检测低浓度禽流感病毒,笔者通过将高特异性的抗原-抗体反应与高灵敏性的PCR扩增技术相结合,建立了一种快速检测痕量H5亚型禽流感病毒的间接免疫PCR方法和间接"三明治"抗体夹心免疫PCR方法。以TopYield 96孔板为固相免疫吸附载体,以禽流感病毒H5蛋白为检测对象,通过一系列免疫反应及亲和素-生物素桥联作用,将生物素标记的报告DNA分子和生物素标记的禽流感病毒H5亚型抗体分子连接。充分洗涤后,在TopYield板孔中添加PCR反应液,对板壁偶联的报告DNA进行PCR扩增,间接达到检测微量禽流感病毒H5蛋白的目标。通过优化报告DNA分子和链亲和素的浓度,2种免疫PCR技术都可检测到约1fg的禽流感病毒H5蛋白,与常规ELISA方法相比,灵敏性提高了近1 000倍。

禽流感病毒A型和H5亚型RT-PCR检测试剂盒研究

目的 检测和鉴定A型、H5亚型禽流感病毒 (AIV) ,研发一种高效实用的检测手段。方法 根据Ming ShiuhLee报道的文献设计、合成引物 ,采用反转录和PCR一步法对A型、H5亚型禽流感病毒cDNA进行扩增和电泳鉴定 ,组装成禽流感病毒RT PCR试剂盒 ,对H1～ 15亚型AIV参考株、38份AIV国内分离株进行检测试验。结果 建立了A型、H5亚型禽流感病毒RT PCR检测方法 ,并在此基础上组装试剂盒 ,用A型试剂盒检测时 ,全部AIV毒株均为阳性 ,能检测 1 10 2 4血凝单位禽流感病毒 ;用H5亚型试剂盒检测时 ,仅有H5亚型AIV参考株和 19株H5亚型AIV分离株呈阳性 ,其余H1～H4、H6～H15参考株和H7、H9分离株以及 1株H5分株均为阴性 ,能检测1 6 4血凝单位禽流感病毒。 2种试剂盒对实验感染鸡病料检出率均为 10 0 %。结论 研制的AIVA型、H5亚型RT PCR试剂盒具有特异性强、敏感性高、稳定性和重复性好的特点。