5-Aza-C对人鼻咽癌细胞hTERT基因表达及端粒酶活性的影响

目的研究去甲基化药物5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine,5-Aza-C)对鼻咽癌细胞亚端粒区D4Z4甲基化状态、h TERT基因表达及端粒酶活性的影响。方法常规培养鼻咽癌CNE,CNE1,CNE2及5-8F细胞系。5-Aza-C处理鼻咽癌细胞后,甲基化测序聚合酶链反应(MSP)法检测亚端粒区D4Z4甲基化;RT-PCR检测h TERT m RNA水平;端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplifi cation protocol,TRAP)法检测端粒酶活性。结果 5-Aza-C处理后,四种鼻咽癌细胞系的亚端粒区D4Z4序列的甲基化水平较处理前明显下降。2.5μmol/L 5-Aza-C处理后,四种鼻咽癌细胞h TERT m RNA的表达明显下调,端粒酶活性显著抑制。结论在鼻咽癌的发生中,亚端粒区的DNA甲基化水平紊乱起了一定的作用,去甲基化药物5-Aza-C能下调h TERT表达,抑制端粒酶活性。探讨鼻咽癌细胞中h TERT表达与亚端粒区Cp G岛甲基化状态之间的关系,可能为亚端粒区染色体结构异常在鼻咽癌发生中的作用提供深刻见解。

5-aza-dC、TSA联合MeCP2的RNA干扰质粒对人肺腺癌细胞株A549生物学行为的影响

目的探讨DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞(5-aza-dC)、组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)和甲基化结合蛋白MeCP2的RNA干扰载体Psilencer-2.1-U6-MeCP2对人肺腺癌细胞株A549生物学行为的影响。方法人肺腺癌细胞株A549细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。利用阳离子脂质体将Psilencer-2.1-U6-MeCP2重组质粒转染到A549细胞中。用5μmol/L的5-aza-dC和(或)300nmol/L的TSA处理A549细胞和稳定转染的A549细胞。Annexin V/PI双染法测定各组细胞培养72h后的凋亡情况;应用RT-PCR检测各组细胞培养72h后C/EBPαmRNA的表达。结果 (1)Psilencer-2.1-U6-MeCP2重组质粒能够稳定转染到A549细胞中;(2)5-aza-dC、TSA和Psilencer-2.1-U6-MeCP2重组质粒均能够上调A549细胞C/EBPα基因mRNA的表达、诱导细胞凋亡,且两两联合处理组A549细胞中C/EBPαmRNA的表达水平及凋亡率均明显高于单处理组(均P<0.01)、细胞C/EBPαmRNA的相对表达量及凋亡率在三者联合处理组与两两联合处理组组间比较,差别均有统计学意义(P<0.05);(3)5-aza-dC组、TSA组和Psilencer-2.1-U6-MeCP2重组质粒组在诱导细胞凋亡、增强C/EBPαmRNA的表达方面比较,差别均无统计学意义。结论与单用5-aza-dC、TSA、Psilencer-2.1-U6-MeCP2重组质粒相比,联合运用能够更好的诱导人肺腺癌A549细胞凋亡,增强C/EBPα基因mRNA的表达,且三者联合运用的效果最显著,这将为去甲基化多药联合治疗肺癌提供理论依据。

5-杂氮脱氧胞苷去甲基化作用对白血病细胞株HL-60中SHP-1和C-kit基因表达的影响

本研究旨在探讨SHP-1及C-kit基因在急性白血病HL-60细胞中的表达情况及5-杂氮脱氧胞苷(5-azaCdR)去甲基化作用对SHP-1及C-kit表达的影响。用RT-PCR方法检测药物处理组HL-60细胞与对照组SHP-1、C-kit基因的mRNA的表达水平。用甲基化特异性聚合酶链反应(M SP)检测HL-60细胞中SHP-1、C-kit基因的甲基化状态改变。结果表明,在原本不表达SHP-1 mRNA的HL-60细胞中,经过5-aza-CdR的去甲基化作用后,SHP-1可以重新表达,而使原来高表达的C-kit mRNA水平下降。当0.5、1、2μmol/L 5-aza-CdR分别作用于白血病细胞株时,去甲基化作用增强,SHP-1 mRNA的表达水平呈上升趋势,C-kit mRNA的表达水平呈下降趋势,两两比较表明差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HL-60细胞株中SHP-1 mRNA表达缺如,经去甲基化作用后表达恢复,说明SHP-1基因高度甲基化与白血病发生有关;白血病形成中可能存在C-kit mRNA表达的异常增高。5-aza-CdR对SHP-1与C-kit的表达水平的影响呈剂量依赖性,浓度越高,SHP-1平均表达水平越高,C-kit mRNA表达水平越低,在特定的一个浓度下,呈现时间依赖性。SHP-1 mRNA与C-kit mRNA表达呈负相关,提示白血病细胞中SHP-1表达的降低或缺如消弱了对C-kit信号通路的负调控而在白血病形成中发挥作用。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对宫颈癌细胞增殖及N-ras、c-myc基因表达的影响

目的探讨5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对宫颈癌细胞增殖及N-ras、c-myc基因表达的影响。方法取对数生长期宫颈癌Hela细胞随机分为对照组、低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组,分别给予终浓度为0、1、5、10μmol·L-1的5-Aza-CdR进行干预,采用四甲基偶氮唑盐法检测干预24、48、72、96 h时Hela细胞增殖能力,流式细胞仪检测干预24 h时Hela细胞凋亡率,免疫印迹和实时荧光定量聚合酶链反应法检测干预24 h时Hela细胞N-ras、c-myc蛋白及mRNA水平,酶联免疫吸附法检测干预24 h时Hela细胞上清液中转化生长因子-β1(TGF-β1)及前列腺素E 2(PGE 2)水平。结果干预24 h时,各组Hela细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05);干预48、72、96 h时,低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组Hela细胞增殖能力均显著低于对照组(P<0.05),高剂量5-Aza-CdR组Hela细胞增殖能力显著低于低剂量5-Aza-CdR组和中剂量5-Aza-CdR组(P<0.05);干预72、96 h时,中剂量5-Aza-CdR组Hela细胞增殖能力显著低于低剂量5-Aza-CdR组(P<0.05)。低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组Hela细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05);低剂量5-Aza-CdR组Hela细胞凋亡率显著低于中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组(P<0.05);中剂量5-Aza-CdR组Hela细胞凋亡率显著低于高剂量5-Aza-CdR组(P<0.05)。低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组Hela细胞中N-ras及c-myc蛋白和mRNA相对表达量显著低于对照组(P<0.05);低剂量5-Aza-CdR组Hela细胞中N-ras及c-myc蛋白和mRNA相对表达量显著高于中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组,中剂量5-Aza-CdR组Hela细胞中N-ras及c-myc蛋白和mRNA相对表达量显著高于高剂量5-Aza-CdR组(P<0.05)。低剂量5-Aza-CdR组、中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组Hela细胞上清液中TGF-β1水平显著高于对照组,PGE 2水平显著低于对照组(P<0.05);低剂量5-Aza-CdR组Hela细胞上清液中TGF-β1水平显著低于中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组,PGE 2水平显著高于中剂量5-Aza-CdR组及高剂量5-Aza-CdR组(P<0.05);中剂量5-Aza-CdR组Hela细胞上清液中TGF-β1水平显著低于高剂量5-Aza-CdR组,PGE 2水平显著高于高剂量5-Aza-CdR组(P<0.05)。结论5-Aza-dc能够通过下调N-ras、c-myc基因表达抑制宫颈癌细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能与TGF-β1水平升高、PGE 2水平降低相关。

血管内皮生长因子C在胃癌的表达及5-氮杂-2’-脱氧胞苷的影响

目的:探讨血管内皮生长因子C(Vascular endothelial growthfactor C,VEGF-C)在胃癌的表达及去甲基化试剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对其表达的影响。方法:免疫组化法检测68例胃癌切除标本的VEGF-C蛋白表达与Flt-4阳性微脉管密度(Flt-4-positive vessel density,FVD)、微血管密度(microvessel density,MVD),同时采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测7株胃癌细胞株的VEGF-CmRNA表达,观察5-Aza-CdR干预对其表达的影响。结果:胃癌组织VEGF-C表达阳性率为54.4%(37/68),与FVD、MVD及淋巴侵犯显著相关。VEGF-C mRNA表达于5株胃癌细胞株,2株(MKN-45,MKN-74)未测到VEGF-CmRNA表达,但以5-Aza-CdR处理后恢复表达。结论:VEGF-C与胃癌Flt-4阳性微脉管、MVD及淋巴侵犯显著相关,其表达可能受甲基化调控。

5氮-杂-2′-脱氧胞苷对胃癌细胞中HLA-C表达的影响

目的:研究5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对胃癌细胞中人白细胞抗原C(HLA-C)表达的影响及其与DNA甲基转移酶1(DNMT1)的关系。方法:用终浓度为10μmol/L的5-Aza-CdR处理培养胃癌细胞(实验组),以未处理细胞作为对照;HLA-C和DNMT1基因的转录表达使用半定量RT-PCR检测;HLA-C的甲基化状态使用甲基化特异性PCR(MSP)检测。结果:5-Aza-CdR处理降低了BGC823细胞中DNMT1基因在转录水平的表达;HLA-C CpG岛的甲基化水平降低;HLA-C mRNA表达量明显上调,对电泳条带的半定量分析显示实验组和对照组之间的差异有统计学意义(P<0.01)。结论:5-Aza-CdR通过抑制DNMT1的表达,改变胃癌细胞中HLA-C基因的异常甲基化状态,进而上调HLA-C的表达。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷联合曲古霉素 A 对高糖诱导下胰岛 β 细胞的增殖及 PDX-1 甲基化的影响

目的：探讨高糖诱导下应用5-氮杂-2~′-脱氧胞苷（5-Aza-d C）和曲古霉素A（TSA）对胰岛β细胞NIT-1细胞株增殖及PDX-1启动子区甲基化及其表达的影响。方法：胰岛β细胞株予33.3 mmol/L葡萄糖浓度处理后随机分为：空白对照（NC）组、高糖诱导（HG）组、5-Aza-d C干预组、TSA干预组、5-Aza-d C＋TSA联合干预组,检测细胞增殖情况、胰岛素释放水平、PDX-1启动子区甲基化状态及其表达水平的变化。结果：5-Aza-d C和TSA单独或联合干预可增加NIT-1细胞增殖率和胰岛素分泌量,降低PDX-1启动子区甲基化产物,增加PDX-1 m RNA相对表达量,并且联合组比单药组效果更加明显（均P〈0.05）。结论：5-Aza-d C和TSA可以激活高糖诱导下失表达的PDX-1,进而恢复胰岛β细胞功能,两药联合具有协同效应。

5-氮-2′-脱氧胞苷联合曲古抑菌素A对人肺腺癌细胞株A549增殖和凋亡的影响

目的探讨DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-dC)联合组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对人肺腺癌细胞株A549增殖和凋亡的影响。方法人肺腺癌细胞株A549细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。实验分4组,5-aza-dC组:细胞接种20h后,加入5μmol/L的5-aza-dC;TSA组:细胞接种20h后,加入300nmol/LTSA;5-aza-dC+TSA组:细胞接种20h后,加入5μmol/L5-aza-dC,24h后再加入300nmol/L TSA;对照组:DMEM培养液中加入等量的二甲基亚砜(DMSO)。MTT比色法测定各处理因素对A549细胞生长的影响;Annexin V/PI双染法测定各组细胞培养72h后的凋亡情况;应用RT-PCR检测各组细胞培养72h后细胞CCAAT增强子启动蛋白α(C/EBPα)mRNA的表达。结果 (1)5-aza-dC及TSA呈时间依赖性地抑制A549细胞的生长,而在同一时间不同组别比较联合用药组细胞生长抑制率较单用药组明显增加[12h:35.51%vs21.63%,19.59%;24h:43.19%vs32.39%,30.60%;36h:54.85%vs38.83%,37.35%;48h:60.69%vs45.79%,43.84%;60h:68.92%vs50.60%,50.20%;72h:74.54%vs59.23%,57.82,P<0.05];(2)5-aza-dC和TSA能够诱导A549细胞凋亡,且联合用药组A549细胞凋亡率(75.35±1.46)%明显高于5-aza-dC(49.76±1.32)%(P<0.05)和TSA组(50.88±1.06)%(P<0.05);(3)5-aza-dC和TSA能够上调C/EBPαmRNA的表达,联合用药组中C/EBPαmRNA表达量(0.581±0.024)明显高于5-aza-dC组(0.402±0.016)(P<0.05)和TSA组(0.394±0.031)(P<0.05),有统计学意义;(4)5-aza-dC组与TSA组在抑制A549细胞生长、诱导细胞凋亡、增强C/EBPαmRNA的表达方面比较,差别均无统计学意义(P>0.05)。结论与单用5-aza-dC或TSA相比,联合应用两种药物能够更好的抑制人肺腺癌A549细胞的增殖、诱导细胞凋亡和增强C/EBPα基因mRNA的表达。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对人甲状腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其机制的研究

目的观察去甲基化制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法将人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞接种于16只BALB/c雌性裸鼠右前肢腋下。移植瘤模型建立后,用随机数字表法将裸鼠分为2组,实验组按照1μg/g腹腔注射5-Aza-CdR 200μL,每2 d给药1次,给药4周。对照组腹腔注射等体积生理盐水。末次给药后处死荷瘤鼠,观察2组裸鼠移植瘤的生长情况,HE染色观察移植瘤的病理形态学改变,采用甲基化特异性PCR检测死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因甲基化程度,采用免疫组化染色与Western blot检测DAPK和DNA甲基转移酶(DNMTs)的蛋白表达水平。结果经药物干预4周后,实验组移植瘤体积和质量均较对照组明显减少(P<0.05),相比对照组,实验组抑瘤率为45.38%。HE染色结果显示,实验组肿瘤细胞数量减少,部分区域肿瘤细胞核淡染、缩小,局部出现核固缩、核溶解。实验组DAPK基因甲基化程度低于对照组。免疫组化染色和Western blot结果显示,实验组DAPK蛋白表达量明显高于对照组,DNMT1、DNMT3A蛋白表达量低于对照组,差异有统计学意义(均P<0.05),2组DNMT3B的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论5-Aza-CdR可通过调节裸鼠移植瘤内DNMTs来提高DAPK的表达,从而抑制甲状腺乳头状癌生长。

5-Aza-C对鼻咽癌细胞端粒长度及细胞增殖的影响

目的:研究去甲基化药物5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine,5-Aza-C)对鼻咽癌细胞端粒长度及细胞生长增殖的影响。方法:常规培养鼻咽癌CNE,CNE1,CNE2及5-8F细胞系,5-Aza-C处理鼻咽癌细胞后,甲基化测序聚合酶链反应(MSP)法检测亚端粒区D4Z4甲基化,端粒限制性片断检测端粒长度,CCK-8检测细胞增殖。结果:2.5μM浓度的5-Aza-C处理后,亚端粒区D4Z4序列的甲基化水平明显下降,约在15-20%之间,与处理前的甲基化水平(35-48%)有明显差异,差异均有统计学意义(P<0.05)。在1μM和2.5μM浓度的5-Aza-C处理后,四种细胞的端粒长度明显缩短,长度在2-4.5kb之间,差异具有统计学意义(P<0.05)。5μM的5-Aza-C处理72 h后,CNE,CNE1,CNE2和5-8F的生存率分别为51.27%,50.46%,48.85%,48.83%,10μM的5-aza C处理72h后,CNE,CNE1,CNE2和5-8F的生存率分别为31.64%,32.34%,30.01%,32.10%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:5-Aza-C能缩短端粒长度,抑制鼻咽癌细胞生长增殖活性。

小鼠DAZL基因启动子核心区域分析及甲基化对其启动活性的影响

旨在确定小鼠DAZL启动子基本活性区,并分析启动子区域甲基化对其启动子活性的影响,探究小鼠DAZL的表达调控机制。采用PCR法扩增不同长度的小鼠DAZL启动子,插入到p EGFP-N1和p GL3-Basic载体,构建重组载体。将重组载体转染GC-1细胞系,并通过添加适量DNA甲基化转移酶抑制剂(5-azacytidine,5-aza-C)逆转各试验组启动子片段的甲基化水平,然后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测DAZL活性变化。双荧光素酶活性检测结果表明,小鼠Dazl启动子基本活性区域为5’侧翼区-370^-36 bp,在-370^-166 bp区域存在不可或缺的重要调控元件;经5-aza-C处理后,各缺失片段载体转染的GC-1细胞DAZL的启动子活性与对照组相比均有不同程度的提升,但差异不显著。本试验确定了小鼠DAZL启动子基本活性区域,证明降低小鼠睾丸DAZL启动子区域甲基化水平,有助于DAZL在生殖细胞中特异性表达,为进一步探究DAZL生物学功能和调控机制提供参考。

全反式维甲酸诱导经典型霍奇金淋巴瘤B细胞表型

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)对经典型霍奇金淋巴瘤B细胞表型的诱导作用。方法构建含有G418抗性的B细胞特异性启动子(CD19,CD79a和CD79b)表达载体,转染霍奇金淋巴瘤细胞并筛选稳定克隆。PCR扩增启动子和荧光素酶序列验证其稳定整合,敲除ABF1后检测外源B细胞启动子活性的改变以验证其功能。检测不同浓度的ATRA在不同时间点对外源B细胞启动子活性的诱导作用,通过实时定量PCR进一步证实ATRA对B细胞特异性基因转录水平的影响;检测ATRA与去甲基化药物5-Aza联合处理对B细胞标记物表达的影响;通过流式细胞染色技术仪检测ATRA对霍奇金淋巴瘤细胞表面标记物CD30表达的影响。结果 ATRA能够诱导人经典型霍奇金淋巴瘤B细胞特异性标记物CD19、CD20、CD79a和CD79b的表达,与5-Aza具有协同诱导作用,并下调细胞表面霍奇金特异性抗原CD30的表达。结论 ATRA能够诱导B细胞表型缺失的经典型霍奇金淋巴瘤向B细胞型淋巴瘤转化。

5-氮杂胞苷影响LjFNS Ⅱ1.1和LjFNS Ⅱ2.1催化金银花木犀草素和木犀草苷合成机制的研究

该研究通过对金银花叶片进行不同时间(1,2,3 d)与不同浓度(20,40,60,80,100μmol·L-1)的5-氮杂胞苷处理,探索5-氮杂胞苷影响黄酮合酶FNSⅡ催化木犀草素和木犀草苷合成的机制。首先对Lj FNSⅡ1.1,Lj FNSⅡ2.1进行克隆;其次UPLC-MS/MS测定金银花叶中木犀草素与木犀草苷的含量,以及Real-Time PCR分析Lj FNSⅡ1.1,Lj FNSⅡ2.1的表达水平,结果表明Lj FNSⅡ1.1,Lj FNSⅡ2.1基因的表达水平与木犀草素的含量变化趋势大体一致,但与木犀草苷的含量变化相关性不显著;同时发现二者之间的表达水平略有差异。研究结果表明,5-氮杂胞苷处理金银花叶片后,Lj FNSⅡ1.1,Lj FNSⅡ2.1的表达水平上升,从而调控木犀草素和木犀草苷的含量升高,为研究Lj FNSⅡ1.1,Lj FNSⅡ2.1催化木犀草素和木犀草苷合成机制提供技术支撑和理论基础。