差速贴壁联合应用5-BrdU对心肌细胞纯度及活力的影响

目的研究多次差速贴壁并联合应用5-溴脱氧尿苷（5-BrdU）对分离的心肌细胞纯度及活性的影响。方法以酶消化法分离乳鼠心肌细胞，分别进行1—3次差速贴壁并联用或不联用5-BrdU以纯化心肌细胞。正常培养3d后，观察细胞的形态特征。用流式细胞技术分析各实验组心肌细胞的纯度。以台盼蓝染色、MTT比色法及细胞线粒体内膜功能检测（流式细胞术）来反映各实验组心肌细胞的活性。结果随着差速贴壁次数的增加，心肌细胞得以纯化，但细胞的活性有所下降。联用5-BrdU后细胞纯度进一步提高，且对细胞的活性无明显影响；其中两次差速贴壁并联合应用5-BrdU后，可获得纯度高、活性好的心肌细胞。结论两次差速贴壁并联合应用5-BrdU为纯化心肌细胞的有效方法。

静脉移植5-BrdU标记骨髓间充质干细胞参与创面愈合的作用研究

目的:探讨经尾静脉移植入体内的骨髓间充质干细胞(BMSCs)参与皮肤创面愈合的情况。方法:以SD大鼠为研究对象,分离、培养并鉴定大鼠BMSCs。制作大鼠全层皮肤缺损动物模型;经尾静脉注入经5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞,于不同时间点(3、7、14、21、28天)观察移植细胞参与创面愈合的情况。结果:经流式细胞仪鉴定细胞表达CD29、CD90表达阳性;CD45表达呈阴性;经体外标记的5-溴脱氧尿嘧啶标记率>90%;标记后的干细胞进行移植4周后,实验组大鼠创面局部及边缘可见BrdU标记的阳性细胞聚集,对照组中未发现明显的聚集现象。结论:5-BrdU完全能够满足移植细胞的标记需要。经尾静脉注射移植入体内的BMSCs可能参与皮肤创面愈合。

5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞对大鼠创面愈合的作用研究

目的:探讨经5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)标记的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在大鼠创面愈合中的作用。方法:分离培养大鼠BMSCs并用流式细胞仪技术鉴定。将大鼠背部脊柱一侧作为实验组并制作一全层皮肤缺损模型,其对侧为对照组,经尾静脉注入经5-BrdU标记的BMSCs,移植细胞数为2×107个。术后3天、7天、14天、21天、28天分批处死动物,观察移植细胞参与创面愈合的情况。结果:流式细胞仪鉴定细胞表达CD29、CD90表达阳性;CD45表达呈阴性。实验组:经5-BrdU体外标记的BMSCs进行细胞移植14天后大鼠创面局部及边缘可见5-BrdU标记的阳性细胞聚集,免疫组化染色可见基底层、真皮层、新生血管周围有散在红棕色标记细胞;对照组中未发现明显的聚集现象;抗5-BrdU/FⅧ、5-BrdU/波形蛋白免疫双标技术检测结果显示:在创伤部位有部分BMSCs分化为血管内皮细胞和成纤维细胞参与创面愈合。大鼠对侧正常皮肤中未见明显的BMSCs聚集和增殖分化情况。结论:5-BrdU标记的BMSCs参与皮肤创面愈合。

5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞对大鼠创面愈合的作用研究

目的探讨以5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)标记的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在大鼠创面愈合中的作用。方法分离培养大鼠BMSCs并用流式细胞仪技术鉴定。在大鼠背部脊柱一侧制作全层皮肤缺损模型,实验组经尾静脉注入经5-BrdU标记的BMSCs,移植细胞数为2×107。对照组为5-BrdU标记的BMSC移植的正常大鼠。术后3d、7d、14d、21d、28d分批处死动物,观察移植细胞参与创面愈合的情况。结果流式细胞仪鉴定细胞表达CD29、CD90;CD45表达呈阴性。实验组:经5-BrdU体外标记的BMSCs进行细胞移植14d后,大鼠创面局部及边缘可见5-BrdU标记的阳性细胞聚集,免疫组化染色可见基底层、真皮层、新生血管周围有散在红棕色标记细胞;对照组中未发现明显的聚集现象;抗BrdU/FⅧ、BrdU/波形蛋白免疫双标技术检测结果显示:在创伤部位有部分BMSCs分化为血管内皮细胞和成纤维细胞参与创面愈合。大鼠正常皮肤中未见明显的BMSCs聚集和增殖分化情况。结论经尾静脉注射移植的BMSCs参与皮肤创面愈合。

体外冲击波结合自体5-BrdU标记骨髓间充质干细胞移植治疗骨不连的实验研究

目的在体外成功分离培养标记兔骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的基础上,观察体外冲击波疗法(Extracorporeal shock wave therapy,ESWT)结合自体BMSCs移植治疗骨不连的疗效。方法制作兔骨不连模型并根据干预方式不同随机分为4个组:冲击波结合干细胞组,干细胞组,冲击波组,完全对照组。定期拍片测量骨折间隙宽度变化(2周、6周、10周)、免疫组化观察,10周后比较愈合率。结果标记后的干细胞移植6周后,在冲击波结合干细胞组、干细胞组骨痂中可见(5-bromodeoxyuridine,BrdU)标记的阳性细胞聚集,冲击波组和对照组中未发现明显的聚集现象;冲击波结合干细胞组干预后6周、10周,与其它各组骨不连间隙差异有显著性;10周后冲击波结合干细胞组骨不连愈合效果好,与其他各组统计学上差异有意义。结论移植的自体干细胞可能参与了骨不连的成骨,结合冲击波的微动力学刺激,有利于骨折的愈合,有望成为一种较好的骨不连治疗方法 。

芪棱汤对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠5-BrdU蛋白表达的影响

目的：探讨芪棱汤对局灶性脑缺血再灌注大鼠5-Brdu蛋白表达的影响。方法：将大鼠随机分为假手术组、模型组、芪棱汤去养阴药组及芪棱汤组。采用颈内动脉线栓加环扎法复制大鼠局灶性脑缺血再灌注模型（MCAO＼Reperfusion）。在再灌注后不同时间点采用免疫组化法检测5-BrdU蛋白表达。结果：芪棱汤去养阴药汤组与芪棱汤组5-BrdU蛋白表达明显多于模型组（P〈0．05），且芪棱汤5-BrdU蛋白表达明显多于芪棱汤去养阴药汤组（P〈0．05）。结论：芪棱汤能够促进5-Brdu蛋白表达，其可能通过刺激内源性神经干细胞增殖达到神经保护作用。

BrdU标记检测大鼠垂体前叶细胞的增殖功能

目的:为了观察大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞的增殖水平,建立一种快速、准确、灵敏、无同位素污染的检测垂体前叶细胞增殖的方法。方法:应用原代培养大鼠垂体前叶细胞,加入5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)标记细胞增殖,用抗BrdU抗体进行免疫细胞化学染色,观察大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞增殖能力。结果:大鼠垂体前叶细胞可见Br-dU阳性标记内分泌细胞,其细胞核内可见棕褐色阳性颗粒,核浆比例增大,呈颗粒状,提示处于细胞增殖期。免疫细胞双重染色表明,体外培养垂体前叶的生长激素细胞、催乳素细胞、促肾上腺皮质激素细胞均具有一定的增殖能力。结论:BrdU标记是一种有效的标记垂体前叶细胞增殖的方法,为探究大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞增殖能力提供了理论基础。

BrdU和EGFP标记大鼠骨髓间充质干细胞的对比研究

目的:研究5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-21-deoxyuridine,BrdU)和腺病毒介导的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的最佳标记时间与剂量,并进行比较。方法:密度梯度离心分离大鼠骨髓MSCs并体外扩增。AdCMV-EGFP分为100、200、400及800 particles/cell四组进行转染;BrdU以终浓度5、10、15μmol/L进行标记。分别于实验第1、3、5、7 d检测两种方法对MSCs的标记率。通过MTT检测两种标记方法对细胞增殖活性的影响。结果:AdCMV-EGFP以100 par-ticles/cell转染未引起MSCs凋亡,转染3d时效率最高(44.4±3.5%);BrdU以10μmol/L、标记3 d的标记率为(75.1±3.1)%。两种方法均不影响细胞增殖。结论:AdCMV-EGFP和BrdU均可高效标记MSCs,根据研究需要不同均可作为高效的MSCs标记方法。

BrdU抗血清制备和应用的研究——Ⅱ.应用BrdU抗体技术显示BrdU标记的染色体和DNA

使用高度特异的BrdU抗血清,通过酶标第二抗体和DAB-H_2O_2或AEC-H_2O_2显色法,成功地显示了CHO和人染色体的BrdU标记区域。使用同样的程序和方法亦成功地显示了硝酸纤维膜上pg水平的BrdU-DNA印迹点。

用BrdU法检测外周血淋巴细胞hprt突变的方法学探讨

目的 探索用 5 -溴脱氧尿嘧啶 (5 bromodeoxyuridine,BrdU)法检测次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因 (hypoxanthine guaninephosphoribosytransferasegene,hprt)突变的操作程序。 方法 用正交设计法就BrdU法的最佳检测条件进行了探讨。结果 本研究所得的最佳操作程序是 :将血样放入 4℃冰箱中冷藏2 4h ;培养基中 6 巯基鸟嘌呤 (6 thioguanine ,6 TG)最终浓度为 1×10 -4mol/L ;BrdU最终浓度用1× 10 -4mol/L ;加入BrdU后培养时间为 16h ;Giemsa染液浓度为 4 % ;染色时间为 15min。结论 BrdU法是一种较好的检测hprt突变的方法。

酸角对Brdu和MNNG致突变作用的影响

本文用人体外周血淋巴细胞SCE和MN试验研究酸角抗Brdu和MN-NG的诱变作用．酸角能降低Brdu诱发的SCE，试验组的S田频率随酸角剂量增加而降低，与对照组比有统计学意义，酸角能明显降低MNNO诱发的SCE和MN，试验组的SCE频率和MN发生率与阳性对照组比差异非常显著，并有明确的剂量一反应关系，抑制率分别为62．38～94．6％和100～125％。结果表明，酸角对Brdu和MMNG的诱变性有抑制作用。

“综合修复法”在BrdU免疫组化染色中的应用

目的探讨Brdu免疫组织化学染色的最佳修复方法。方法采用不同的抗原修复方法:酶修复,pH6.0柠檬酸盐缓冲液高压修复或微波修复,pH 9.0 Tris-EDTA高压修复或微波修复,以及0.1%Triton X-100/0.1%柠檬酸钠渗透及胰酶增加细胞膜的通透性、冷0.1mol/L盐酸去除染色体组蛋白、2mol/L盐酸使DNA双链变性、四硼酸钠重建碱性环境的"综合修复法",对小鼠BrdU标记的嗅上皮组织进行免疫组织化学染色。结果经"综合修复"后,免疫组化染色敏感性较其他修复方法明显增强,并且准确定位优于其他方法(P<0.01)。结论在BrdU的免疫组化染色中,"综合修复法"是较理想的抗原修复方法。

BrdU-ELISA法测定四逆汤及组方药提取物对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察四逆汤 (SNT)及组方药提取物对大鼠主动脉血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖的影响。方法采用 MTT比色法和 Brd U- EL ISA法观察药物对离体大鼠 VSMC增殖的影响。结果 Brd U- EL ISA法结果表明四逆汤总提取物 (EST)对 VSMC的 Brd U掺入 DNA没有显著影响 ,而 MTT测定表明 EST可以提高 VSMC的脱氢酶活性。甘草 (L E)、附子 (AE)、干姜 (GE)、甘草加附子 (L AE)、干姜加附子 (AGE)提取物显著提高VSMC的脱氢酶活性 ,同时提高 VSMC的 Brd U掺入 DNA的水平。结论 EST可以增加 VSMC的脱氢酶活性 ,但对 VSMC的 Brd U掺入 DNA的水平无影响。而其他组方药提取物可以增加 VSMC的脱氢酶活性 ,同时提高VSMC的 Brd U掺入 DNA的水平。

胸腺嘧啶和5-溴脱氧尿嘧啶诱导小鼠白血病细胞同步化

目的；用胸腺嘧啶和５－溴脱氧尿嘧啶联合作用小鼠红白血病细胞，建立白血血病细胞同步化方法。方法：参照遗传学人外周血细胞同步化方法，细胞生长状态好的加入胸腺嘧啶，培养一定时间后加入５－溴脱氧尿嘧啶培养４．５－５小时后加入积水仙素，常规制备中期染色体标本，根据分裂相的多少了解同步化的效率。结果：经诱导后可获得大量中期染色体分裂相。

脂多糖抑制海马神经前体细胞增殖

目的探讨脂多糖(LPS)对大鼠海马齿状回(DG)的神经发生的影响及机制。方法大鼠腹腔注射LPS(1 mg/ml)后,用免疫组织化学方法检测海马DG的颗粒下层5溴脱氧尿嘧啶(BrdU)的阳性细胞和诱发的钙接头蛋白分子Iba1蛋白的表达;用免疫荧光双标的方法检测BrdU和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、双皮质醇(DCX)的共表达;新生大鼠海马分离培养神经干细胞,采用免疫细胞法检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达,检测LPS对神经前体细胞分化的影响和LPS受体Toll样受体(TLR)4的表达。结果LPS能使青少年雄性大鼠发育迟缓,体重增长延迟;急性抑制成年大鼠DG区的神经发生。结论LPS可能通过激活TLR4途径抑制神经前体细胞的增殖。

原代培养大鼠松果体细胞的增殖与分化——免疫组织化学研究

目的 探讨体外培养大鼠松果体细胞的生长、增殖及分化。方法 采用 MTT测定法、Brd U及 5 - HT免疫组织化学方法。结果 相差显微镜观察可见培养的松果体细胞呈小圆形或不规则形 ,初期聚集成巢 ,以后逐渐分散贴壁 ,有强折光性 ,细胞体积随培养时间的延长而增大。MTT检测证实 ,培养的松果体细胞增生较活跃 ,细胞倍增时间在培养第 9天 ,第 11天左右达高峰。 Brd U免疫组化法对松果体细胞分裂与增值的观察及统计结果与 MTT检测结果相符。 5 - HT阳性细胞占培养细胞总数的 80 %以上。结论 体外培养能获得生长增殖旺盛、具有一定生理功能的松果体细胞。

小鼠缺血再灌注损伤后海马齿状回Wnt1、Wnt3a的表达变化

目的探讨Wnt/β-catenin相关因子在缺血再灌注小鼠海马中的表达变化。方法将80只1月龄健康雄性昆明小鼠随机分为正常组、假手术组、缺血再灌注1、3、7、14、21、28 d组,通过夹闭小鼠双侧颈总动脉0.5 h再通的方法建立小鼠脑缺血再灌注损伤模型,采用腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核甘(BrdU)检测海马齿状回区神经干细胞(NSCs)增殖规律及通过原位杂交法和免疫组织化学染色方法检测Wnt/β-catenin信号通路重要信号分子Wnt1、Wnt3a的表达变化。结果 BrdU检测显示正常组和假手术组小鼠海马齿状回区可见少量BrdU阳性细胞,缺血再灌注后3 d BrdU阳性细胞开始增高(P<0.01),缺血再灌注后7 d达高峰(P<0.01),随着灌注时间的延长呈下降趋势,缺血再灌注后28 d,BrdU阳性细胞数降至正常水平(P>0.05)。原位杂交法结果显示正常组、假手术组海马齿状回颗粒细胞下层均无明显Wnt1、Wnt3a阳性表达。缺血再灌注各组均可见Wnt1、Wnt3a阳性细胞,再灌注后1 d表达开始增加,14 d达高峰,28 d减少至正常水平。与正常组和假手术组比较,缺血再灌注各组Wnt1、Wnt3a阳性细胞数明显增多(P<0.05)。结论小鼠脑缺血再灌注损伤可激发内源性NSCs的增殖。当Wnt/β-catenin途径被激活时,Wnt1、Wnt3a在海马齿状回颗粒细胞下层的表达,为进一步研究Wnt信号通路在脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制奠定了基础。

施万细胞长期植入中枢神经系统后存活及迁移的实验研究

目的观察施万细胞长期移植入中枢神经系统后是否存活。方法取大鼠施万细胞体外培养,一部分经5'溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记后移植至电针损伤的大鼠中脑网状结构,另一部分经Hoechst33342标记后置于PLGA支架内再移植至大鼠全横断脊髓损伤处,分别于移植后的8个月和11个月处死动物,行BrdU免疫组织化学染色及荧光显微镜观察。结果施万细胞移植入脑内8个月后仍可见较多BrdU阳性细胞,褐色椭圆形,并向大脑皮层迁移;移植于脊髓11个月后荧光显微镜下可见许多Hoechst33342阳性细胞,发蓝色荧光,形态不规则,在PLGA支架内及其头、尾端脊髓实质内都可见到。结论施万细胞移植入中枢神经系统后可长期存活,并向远端迁移。

反映成年大鼠脑组织神经发生水平显示方法的灵敏性和可靠性评价

目的评价反映成年大鼠脑组织神经发生水平的显示方法。方法采用免疫细胞化学法观察溴化脱氧尿核苷(BrdU)显示细胞增殖的可靠性、灵敏性,以及寻找BrdU给药的合适剂量。结果BrdU25mg/kg剂量组与50mg/kg、100mg/kg组相比,齿状回BrdU阳性细胞数差异明显(P<0.05),50mg/kg和100mg/kg两组无显著性差异(P>0.05)。BrdU25mg/kg剂量组阳性细胞不易与周围细胞区分;50mg/kg剂量组和100mg/kg剂量组阳性细胞较易识别。且BrdU阳性细胞大多数分化为神经元。结论BrdU标记法可以准确反映成年大鼠脑组织神经发生水平。

骨髓间充质干细胞移植在急性肝损伤大鼠肝脏内定植能力的实验研究

目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在急性肝损伤大鼠肝脏内移植情况。方法:首先行大鼠骨髓间充质干细胞提取、分离和培养,传代扩增后用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记,用D-氨基半乳糖(1.5g/Kg)腹腔注射制备大鼠急性肝损伤模型,试验分三组(A、B、C组),经阴囊上静脉向肝损伤组(A组)及肝脏正常(C组)的大鼠移植标记BrdU的BMSCs 1～1.5×106,同时向肝损伤组(B组)的大鼠移植等量的生理盐水。2周后观察大鼠的存活率及肝功能恢复情况,并通过免疫组织化学方法检测大鼠肝脏中BrdU+细胞数量及分布。结果:移植2周A组、B组动物存活率、肝功能恢复情况无明显差异,肝损伤组(A组)及肝脏正常组(C组)大鼠肝脏均可检测到BrdU+细胞分布,A组与C组相比,A组BrdU+细胞数较多,分布更广,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:骨髓间充质干细胞可以在受损的肝脏及正常肝脏定植,定植的数量可能和肝脏是否受损伤相关。