鸡柔嫩艾美耳球虫ZJ株5401基因在大肠杆菌中的表达

根据E.tenella子孢子表面抗原5401基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上 EcoRⅠ和 SalⅠ酶切位点及保护碱基,用RT PCR方法从E.tenella孢子化卵囊扩增出881 bp的片段。将重组克隆质粒pGEM- T -5401用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,电泳回收目的片段,克隆到同样经 EcoRⅠ和 SalⅠ双酶切的表达载体 pET -30a中,得到重组表达质粒pET- 30a 5401,把重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出了His- 5401融合蛋白。Western印迹结果表明表达产物为大约66.2 ku的蛋白。

鸡柔嫩艾美耳球虫江苏分离株5401基因的克隆、序列分析及原核表达

分别以孢子化卵囊及第2代裂殖子为材料,应用RT-PCR技术克隆了柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)江苏分离株5401基因。测序结果表明该序列全长为864bp,序列本身是一个开放阅读框,将克隆得到的基因与国外报道的5401基因比较,第174位和第287位发生突变,碱基分别由T突变为C,由C突变为T。第1个为无义突变,第2个突变引起第96位氨基酸由A变为V。其核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.7%。将所获5401基因克隆到pGEX-4T-2获得重组质粒pGEX-4T-2-5401,转入宿主菌BL21中,用IPTG进行诱导表达。用大鼠抗柔嫩艾美耳球虫子孢子高免血清对原核表达产物进行Western Blotting检测,结果表明有2条融合蛋白,大小分别为90kDa和80kDa左右。

减毒沙门氏菌为载体传递鸡球虫DNA疫苗的安全性、稳定性与免疫原性

将携带鸡柔嫩艾美耳球虫5401基因的真核表达质粒pcDNA 3-5401的减毒沙门氏菌Z J111菌株(Z J111/pcD-NA 3-5401)口服接种于3日龄非免疫鸡,2周后进行第2次接种。结果表明,利用该减毒沙门氏菌作为载体具有相对安全性,用限制性酶切分析和PCR鉴定证实,体内试验和体外培养的重组质粒在受体菌Z J111菌株内比较稳定。用Z J111/pcDNA 3-5401(108cfu)口服接种非免疫鸡,2周后用相同剂量加强免疫1次,二免后2周用柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊攻击,观察其免疫效果。结果表明,重组Z J111/pcDNA 3-5401菌既能诱导产生抗鸡柔嫩艾美耳球虫抗体,也能显著增强淋巴细胞增殖水平(P<0.05);其抗球虫指数为164.98。试验结果显示,利用减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性。