6-DMAP和低渗诱导长牡蛎“海大2号”三倍体的研究

为探索低渗和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)诱导长牡蛎(Crassostrea gigas)三倍体最佳条件以及6-DMAP和低渗配合使用诱导三倍体的可行性,本研究通过低渗、6-DMAP以及6-DMAP与低渗配合三种方法诱导长牡蛎“海大2号”三倍体。研究显示,低渗处理组中,当第一极体(PB1)出现40%时,在盐度为8的低渗海水中持续处理15 min,综合评价指数最高,为34.33%,此时2日龄长牡蛎的三倍体率和存活率分别为73.77%±1.89%和45.78%±6.23%,8日龄长牡蛎的三倍体率和存活率分别为50.65%±4.89%和21.17%±5.54%。6-DMAP处理组中,当PB1出现40%时,75 mg/L的6-DMAP持续处理15 min,综合评价指数最高(36.52%),此时2日龄长牡蛎的三倍体率和存活率分别为74.81%±0.68%和46.30%±1.54%,8日龄长牡蛎的三倍体率和存活率分别为60.37%±0.61%和30.25%±2.85%。6-DMAP和低渗配合组中,当PB1出现40%时,在盐度为8的低渗海水中,以50 mg/L的6-DMAP持续处理15 min,综合评价指数最高(36.18%),此时2日龄长牡蛎的三倍体率和存活率分别为74.34%±3.49%和45.07%±4.41%,8日龄长牡蛎的三倍体率和存活率分别为68.23%±2.52%和40.42%±4.30%。综合比较以上三种方法,通过6-DMAP和低渗配合诱导获得三倍体的倍率更稳定,幼虫存活率更高。研究结果可为长牡蛎“海大2号”三倍体培育提供参考资料。

6-DMAP诱导太平洋牡蛎三倍体——抑制受精卵第二极体释放

于１９９６～１９９７年，用６－ＤＭＡＰ抑制太平洋牡蛎受精卵第二极体的释放，诱导产生三倍体，最高诱导率为９３．８％。该实验组胚胎孵化率为８１．０％，Ｄ形幼虫畸形率为１７．６％。实验选用Ｌ９（３４）设计，进行三因素三水平的正交试验：６－ＤＭＡＰ浓度，设３００、４５０和６００μｍｏｌ／Ｌ等三水平；诱导时机（观察静止状态的受精卵，以受精卵出现第一极体的百分率指示），设１０％、３０％和５０％等三水平；诱导持续时间，设１０、１５和２０ｍｉｎ等三水平，试验设三次重复。解剖法获取精卵，人工授精。染色体倍性检查采用染色体计数法。根据正交试验直观分析结果，得出诱导太平洋牡蛎三倍体各因素的最优水平组合：当３０％受精卵出现第一极体时，将受精卵浸泡在含６－ＤＭＡＰ４５０μｍｏｌ／Ｌ的海水中１０ｍｉｎ；三因素的主次顺序：６－ＤＭＡＰ浓度→诱导时机→诱导持续时间。６－ＤＭＡＰ的浓度和诱导时机对三倍体诱导率的影响显著；但诱导持续时间影响不显著。部分试验组得到４．２％～１３．６％的四倍体和１０％左右的非整倍体，这种情况可能与受精不同步抑制第一极体释放而导致的染色体多极分离有关。

6-DMAP诱导太平洋牡蛎三倍体——4.四倍体现象的研究

１９９６～１９９７年，在进行６－二甲基氨基嘌呤（６－ＤＭＡＰ）诱导太平洋牡蛎产生三倍体的实验过程中，发现一定数量的四倍体。解剖法获取精卵，人工授精。染色体倍性鉴别采用染色体计数法。（１）三因素四水平Ｌ１６（４５）正交设计。试验平行重复２次。最高四倍体诱导率为４０．０±０．０％。太平洋牡蛎四倍体各诱导因素的最优水平组合：当精卵混合２０ｍｉｎ时，将受精卵浸泡在含６－ＤＭＡＰ４５０μｍｏｌＬ－１的海水中１０ｍｉｎ；决定四倍体产生的三因素的主次顺序：６－ＤＭＡＰ浓度→诱导时机→诱导持续时间。（２）三因素三水平Ｌ９（３４）正交设计。试验平行重复３次。最高四倍体诱导率为９．６±４．９％。诱导太平洋牡蛎四倍体各因素的最优水平组合：当５０％受精卵出现第一极体时，将受精卵浸泡在含６－ＤＭＡＰ４５０μｍｏｌＬ－１的海水中１５ｍｉｎ；决定四倍体产生的三因素的主次顺序：诱导时机→６－ＤＭＡＰ浓度→诱导持续时间。

6-DMAP诱导扇贝异源三倍体的细胞学观察

分别在受精后15和30mjn,用60 mg·L^(-1)6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)处理栉孔扇贝(♀)×虾夷扇贝(♂)受精卵诱导异源三倍体,持续处理5～25min。采用二氨基苯基吲哚(DAPI)染色和荧光显微镜观察对处理前后受精卵的染色体行为变化进行了研究,空气干燥法制备染色体检测胚胎倍性。结果表明,无论抑制第一极体或是第二极体释放均能获得正常发育的异源三倍体胚胎;抑制第一极体释放,产生异源三倍体、非整倍体,延长处理时间能获得五倍体;抑制第二极体释放,产生异源三倍体;6-DMAP使染色体运动终止,处理前后,核相无变化,随着处理时间的延长,核相泡状化增强。

CB与6-DMAP诱导香港牡蛎三倍体的效果比较

以三倍体率、卵裂率、D幼率、生产成本等为指标,比较了CB、6-DMAP两种化学试剂诱导香港牡蛎三倍体的效果,研究了试剂浓度、诱导时机、诱导持续时间及受精卵密度等4种因素对香港牡蛎三倍体的诱导效应。结果显示,在温度28~30°C、盐度15~25,受精卵密度为2.0×10~8个/L条件下,采用0.5 mg/L的CB在受精后15~18 min处理,诱导持续时间为20 min,可产生100%三倍体;合子的卵裂率为53.16%~63.00%,D形幼虫孵化率为47.32%~53.09%,诱导效率指数为0.47~0.53,生产成本为260元/L。相同条件下,采用浓度为75~100 mg/L的6-DMAP处理,诱导持续时间为20~25 min,受精卵处理密度4.5×10~7个/L,可产生62.52%~72.36%的三倍体;合子的卵裂率为60.00%~66.25%,D形幼虫孵化率为74.43%~90.00%,诱导效率指数为0.47~0.65,生产成本为139~185元/L。综合比较两种方法,6-DMAP诱导方法更加适合用于大规模的香港牡蛎三倍体苗种生产。本研究为香港牡蛎多倍体育种提供了研究数据与实践经验。

应用6-DMAP人工诱导近江牡蛎三倍体的初步研究

采用6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)抑制受精卵第二极体排放法诱导近江牡蛎产生三倍体,通过6-DMAP浓度、诱导时机、诱导持续时间3因素3水平正交试验设计,得出近江牡蛎三倍体诱导3因素最优水平组合,即当30%受精卵出现第一极体时,将受精卵浸泡在含6-DMAP 450μmol/L的海水中20 min;3因素影响诱导率的主次顺序为:6-DMAP浓度→诱导时机→诱导持续时间。

6-DMAP诱导栉孔扇贝异源雌核发育二倍体

采用紫外线遗传灭活的长牡蛎精子激活栉孔扇贝卵子,运用L9(34)设计不同6-DMAP的处理条件来诱导染色体加倍,获得第二极体抑制型栉孔扇贝雌核发育二倍体早期胚胎。以雌核发育担轮幼虫为材料,滴片法制备染色体并采用计数法统计倍性,分析不同6-DMAP浓度、诱导时机和诱导持续时间对雌核发育二倍体诱导率的影响,并统计早期胚胎畸形率。结果表明,不同6-DMAP浓度、诱导时机和诱导持续时间对异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体的诱导率均有显著影响;早期胚胎畸形率与二倍体的诱导率呈负相关,y=46.632-0.891x(r=-0.813,P<0.01)。6-DMAP诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体的最佳处理条件为:20%～25%受精卵排放出第1极体时,60μg/ml的6-DMAP持续处理25min可得到最高的诱导率为29.5±5.36%。研究结果为6-DMAP诱导栉孔扇贝雌核发育染色体加倍提供了一定的细胞学依据和技术参数。

6-DMAP诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体机理研究

采用多聚甲醛固定、免疫荧光染色的方法,在荧光显微镜下对栉孔扇贝(Chlamys farreri)正常发育受精卵和6-DMAP第二极体抑制型雌核发育卵受精过程中纺锤体变化以及雌雄原核的移动过程进行了观察。结果显示,正常发育受精卵内微管能聚合形成纺锤体并牵引中期染色体移向两极,依次排出第一极体、第二极体,雌雄原核融合为合子核,进行第一次卵裂。雌核发育受精卵内,随6-DMAP处理时间的延长,星体微管消失,纺锤体被拉长变得扁平,最终导致中期纺锤体解散,第二极体的形成被抑制;6-DMAP处理过程中,受精卵中的精核始终处于皮层区域,不能形成雄原核,雌原核和精核几乎不移动,去除6-DMAP后,雌原核和精核恢复移动,但移动速度与对照组相比要慢。

6-DMAP诱导缢蛏三倍体的研究

用6-DMAP抑制受精卵第二极体排放的方法诱导缢蛏三倍体的试验．结果表明：6-DMAP在100～500μmol／dm^3处理浓度范围内均可以诱导出三倍体，随着药物处理浓度和处理时间的提高，三倍体倍化率和D形幼虫畸形率有不同程度的提高，而D形幼虫孵化率会随之下降．综合来看，在30％卵子受精并出现第一极体，6-DMAP浓度为300μmol／dm^3和处理持续时间为20min时的处理组的处理效果优于其他处理组组合．

6-DMAP诱导马氏珠母贝三倍体

用６－二甲基氨基嘌呤（６－ＤＭＡＰ）抑制马氏珠母贝（ＰｉｎｃｔａｄａｍａｒｔｅｎｓｉＤｕｎｋｅｒ）受精卵的极体释放获得三倍体。在２６℃条件下，进行了不同浓度梯度的６－ＤＭＡＰ（４０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１２０ｍｇ／Ｌ）和不同的处理持续时间（５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、２５ｍｉｎ）的诱导实验，抑制第一和第二极体的三倍体诱导率最高分别达３２．４％和５７．７％。随着处理强度的加大，三倍体诱导率增高，但孵化率降低。结合三倍体诱导率和幼虫孵化率，以６－ＤＭＡＰ浓度８０ｍｇ／Ｌ、处理持续时间１０ｍｉｎ最好。

6-DMAP对小鼠卵母细胞减数分裂启动及孤雌发育作用

小鼠卵泡卵母细胞体外培养过程中加入2 mmol/L 6-DMAP可抑制卵母细胞自发的染色质浓缩和生发泡破裂(GVBD)。源自超排的MⅡ期卵母细胞则能为6-DMAP所激活。hCG注射后18—19h的卵母细胞置于2 mmol/L6-DMAP的CZB溶液中培养0.5 h、1h、2h、3h,卵母细胞的激活率分别为26.1%、75.2%、75.8%、77.3%、;卵裂率分别为88.2%、73.2%、67.0%、58.4%。与乙醇激活法相比,6-DMAP处理引起了不同的孤雌激活类型。

6-DMAP对黄瓜根尖细胞微管冷稳定性的影响

用 6 -DMAP(6 -dimethylaminipurine ,二甲氨基嘌呤 )处理黄瓜根尖后 ,应用共焦激光扫描显微镜观察了其对黄瓜根尖细胞中微管冷稳定性和黄瓜根尖冷害程度的影响。结果表明用 1 5mmol/L 6 -DMAP处理黄瓜根尖后 ,细胞中微管的冷稳定性显著增强 ,同时黄瓜根尖的冷害程度明显下降。

6-DMAP诱导栉孔扇贝三倍体的细胞学观察

用Bouin氏液固定、连续石蜡切片方法,对6-二甲基氨基嘌呤(简称6-DMAP)抑制第二极体诱导栉孔扇贝三倍体在受精和早期卵裂过程中的细胞学变化进行了详细观察。结果表明,在授精后25min,以60mg/L的6-DMAP处理栉孔扇贝受精卵15min,有效地破坏了纺锤体结构的形成,抑制了第2次减数分裂进程,致使受精卵内形成两种核相:一种是1个大的二倍性雌核和1个雄核;另一种是两个单倍性的雌核和1个雄核。不论形成几个雌原核,它们都能与雄原核相互靠近,在卵轴中央核膜逐渐发生融合,形成合子核,三倍体的合子核在卵内所占体积明显较二倍体的大。继而,合子核经过DNA复制,最后凝缩成染色体,发生有丝分裂,其过程与正常二倍体相同。

乙醇及6-DMAP对小鼠卵母细胞孤雌激活的研究

实验研究了乙醇、6-DMAP以及二者联合使用时对注射hCG后18小时采集的小鼠卵母细胞孤雌激活的效果。结果证明:(1)用5％的乙醇分别作用5和10分钟及10％的乙醇分别作用5和10分钟,小鼠卵母细胞的孤雌激活率分别为41.3％、63.7％、57.9％和85.6％。说明在一定范围内,随着乙醇浓度和作用时间的增加,小鼠卵母细胞孤雌激活率有上升的趋势。(2)用2mM 6-DMAP作用2、4和6小时,小鼠卵母细胞的孤雌激活率分别为 12.0％、25.0％和40.0％。说明随着6-DMAP作用时间的增加,小鼠卵母细胞的孤雌激活率有所升高。(3)用5％乙醇作用5分钟,再用含有2mmol/L 6-DMAP的培养液培养6小时,小鼠卵母细胞的孤雌激活率可达65.5％,明显高于单独使用5％乙醇作用5分钟或单独使用2mmol/L 6-DMAP作用6小时卵母细胞的孤雌激活率。(4)用10％的乙醇作用5分钟,再用含有2mmol/L 6-DMAP的培养液培养6小时,小鼠卵母细胞的孤雌激活率达到100％,远远高于单独使用10％乙醇作用5分钟或单独使用2mmol/L 6-DMAP作用6小时卵母细胞的孤雌激活率。(5)在单独使用乙醇刺激时,激活卵母细胞中直接卵裂(2-细胞)的比率随乙醇作用强度的增加而增加,最高达62.5％;但6-DMAP则抑制激活卵母细胞的直接卵裂,增加二原核卵的比例。

电脉冲及6-DMAP对小鼠卵母细胞孤雌激活的研究

实验研究了不同电脉冲条件、6-DMAP作用不同时间以及二者联合使用时对注射hCG后18～19h采集的小鼠卵母细胞孤雌激活及发育的效果。结果表明:小鼠卵母细胞电激活后,放入2mmol/L6-DMAP的CZB中作用6h,其激活率和囊胚率都显著高于单独使用一种激活方法。其中场强2.0kv/cm,脉宽80μs,3次脉冲结合6-DMAP组的激活率和囊胚发育率最高,与其他两组差异显著。

6-DMAP和胚胎干细胞代数对异种重构卵体外发育的影响(简报)

核移植技术已经广泛应用于动物克隆,但是克隆动物的成活率仍然很低[1-3].

6-DMAP诱导PM胚胎形成过程中核纤层蛋白B的动力学变化

我们的前期研究发现:被微管抑制剂nocodazole抑制在第一次有丝分裂中期的小鼠受精卵在加入6-DMAP处理后核膜重新出现,并且父、母本的基因组未发生融合,分别形成了类似雌、雄原核的两个细胞核,它们共存于卵细胞质中,我们把这种特殊的胚胎称之为PM胚胎(post-mitoticembryo)。本研究表明:在去除抑制剂3h后未能形成核膜的胚胎进一步卵裂,而形成核膜的PM胚胎培养24h未见进一步发育。此外,我们采用免疫荧光染色观察PM胚胎核膜重现过程中核纤层蛋白B的动力学变化,结果显示:在加入6-DMAP后核纤层蛋白B在染色体周围逐渐聚集,约3h后核膜完全形成,此时核纤层蛋白B在染色体周围的聚集达到最高峰。文中还对6-DMAP诱导核膜形成的机制进行了探讨。

6-DMAP对延边黄牛末期卵母细胞核移植的影响

为探讨6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)在延边黄牛末期去核的体细胞克隆中的作用,本试验主要研究了单独使用离子霉素处理与离子霉素联合添加6-DMAP处理对体外成熟的老化延边黄牛卵母细胞的激活率的不同影响;以及不同时期添加6-DMAP对重构胚后期发育能力的影响。试验结果显示,体外成熟的老化卵母细胞,使用离子霉素单独处理后91%被激活,而在离子霉素联合添加6-DMAP处理后却没有细胞被激活,也就是没有第二极体的排出。另外,融合后使用6-DMAP处理,所得重构胚的囊胚发育率最低,而激活后的卵母细胞立即用6-DMAP处理,所得重构胚的发育能力与无6-DMAP处理的相近。综上所述,离子霉素联合添加6-DMAP可抑制老化的延边黄牛卵母细胞的激活,阻止第二极体的排出,但对重构胚的后期发育没有影响。而融合使用添加6-DMAP的培养液,抑制了重构胚的后期发育。