来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因的合成与融合表达

将来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因用大肠杆菌中的丰沛密码子替换,利用化学和基于聚合酶链反应(PCR)技术的酶促方法进行基因全合成,利用pET-32a构建重组表达载体pET-dan,转化进E.coil BL21(DE3)中进行融合表达.经SDS-PAGE电泳、Western-blot检测和活性测定发现,D-ANase可在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白可达到菌体总蛋白的69.2%,密码子优化后基因构建的工程菌发酵活性为96 U/mL,重组蛋白经超声细胞破碎及Ni2+柱亲和层析纯化,比活可达1692.3 U/mg,纯度可达95%以上.

55例6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏症基因突变分析

目的 了解中国大陆6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏症（6-pyruvoyltetrahydrobiopterin synthesis deficiency，PTPSD）基因突变谱。方法 采用PCR-限制性长度多态性及常规基因测序法，对55例PTPSD进行6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶基因（6-pyruvoyltetrahydrobiopterin syntheie gene，PTS）检测以得出基因突变类型和频率，寻找热点突变；分析基因型与临床表型的关系。结果 PTS基因突变检出率95．28％，检出18种突变类型。P87S（40．57％）、N52S（13．21％）、D96N（12．26％）及IVSInt-291A〉G（10．38％）为热点突变，前3种突变导致严重型PTPSD。P87L为国内首次报道；发现5种新突变（Q13X、M80T、IVS4nt-2A〉G、L93M、K131N）。结论 N52S、P87S、D96N及IVSInt-291A〉G为中国人PTS的热点突变，PCR-限制性长度多态性方法进行热点突变筛检可提高基因诊断效率。