应用改良TAIL-PCR克隆黄瓜6PGDH基因上游序列

运用改良的热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)对黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6-phosphogluconate dehydrogenasegene,6PGDH)的上游序列进行了克隆。与最初的TAIL-PCR相比较,主要改进之处有:(1)根据Primer 5.0软件计算结果从随机RAPD引物库中筛选出合适的上游引物,低严谨和高严谨反应中的退火温度也分别进行了调整;(2)将热不对称交替反应继续应用到第3轮PCR扩增反应中以提高特异目的条带和减少非目的条带。经过3轮PCR扩增反应最终获得位于黄瓜6PGDH起始密码子ATG上游长度为517 bp新序列。试验结果表明,应用改良TAIL-PCR能快速、有效地克隆与已知区域相邻的序列。

冬小麦lncRNA1808调控PPP限速酶(Ta6PGDH)抗寒应答研究

为探索lncRNA1808调控Ta6PGDH应答寒胁迫的机制,以冬小麦品种东农冬麦1号(Dn1)为材料,应用生物信息学分析了lncRNA1808和Ta6PGDH的生物学特性和功能,预测了lncRNA1808-Ta6PGDH互作关系和共表达趋势;应用real-time PCR鉴定小麦分蘖节和叶片的lncRNA1808和Ta6PGDH寒胁迫下表达谱变化。结果显示,lncRNA1808为lncRNA,不具备编码能力,富含稳定的茎环结构;lncRNA1808与Ta6PGDH的启动子序列含多种响应环境因子的顺式作用元件;预测lncRNA1808-Ta6PGDH互作并协同共表达;Dn1分蘖节和叶片的lncRNA1808和Ta6PGDH的表达谱与协同共表达分析一致,表达趋势上调。本研究初步揭示了冬小麦lncRNA1808调控PPP限速酶Ta6PGDH的抗寒应答机制。

苹果6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Md6PGDH1的克隆和功能分析

以‘嘎拉’苹果为材料,克隆了6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Md6PGDH1(序列号:MDP0000279299)全长。序列分析显示,该基因包含一个长为1 047 bp完整的开放阅读框,编码347个氨基酸,分子量为36.430 k D,预测等电点为9.24。同源性分析表明Md6PGDH1还有另外3个同源基因;功能域分析表明Md6PGDH蛋白含有两个保守的绑定域;亚细胞预测表明Md6PGDH定位存在差异。分析Md6PGDH1启动子发现存在多个响应非生物胁迫的顺式作用元件。定量分析显示,Md6PGDH1在苹果的不同组织中都有表达,且受非生物胁迫诱导。原核诱导Md6PGDH1蛋白并进行蛋白酶活的测定,为后续蛋白功能鉴定奠定了基础。Md6PGDH1在苹果愈伤组织中过量表达,提高其抗盐胁迫的能力。

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6PGDH)的克隆与甜瓜属异源四倍体的分子验证

根据已发表的黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphog luconate dehydrogenase)基因6PGDH的cDNA序列(GenBank登录号:EU815934)设计引物,扩增了甜瓜属异源四倍体新种及野生种和栽培黄瓜‘北京截头’的6PGDH基因片段,测序结果表明3个种的6PGDH基因片段序列表现出高度的一致性,长度均为1098bp包含936bp编码311个氨基酸的阅读框和162bp的3′非翻译区末端,片段内无内含子存在。利用DNAMAN软件检测到异源四倍体新种与野生种和栽培黄瓜‘北京截头’氨基酸的差异位点有3个,碱基差异位点有22个,差异位点的遗传分布符合孟德尔遗传学定律,从而在分子水平证实了异源四倍体新种是野生种和栽培黄瓜‘北京截头’的杂交后代。

黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

以黄瓜品种露丰为材料,根据已报道的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6PGDH)的保守氨基酸序列设计简并引物,利用RT-PCR技术获得黄瓜6PGDH的cDNA同源片段,命名为CSPG(登录号为EU815934)。该片段长度为1 207 bp,包含一个936 bp的开放阅读框(编码311个氨基酸)和271 bp的Poly A 3′非翻译区末端,无内含子;该基因编码的氨基酸序列与拟南芥、大豆、水稻、玉米、菠菜的6PGDH基因有75%以上的同源性。运用半定量RT-PCR技术对6PGDH基因的转录水平进行分析,结果表明:该基因在叶、根、茎中均有表达,高温胁迫下的表达量高于常温对照,说明6PGDH基因与热胁迫相关。

黄瓜胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因克隆及序列分析

根据6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)基因的保守氨基酸序列设计简并引物,应用RT-PCR技术从黄瓜栽培种品种'北京截头'(Cucumis sativus'Beijingjietou')叶片中获得了640bp的特异片段,以该序列在EST数据库进行同源检索筛选,发现甜瓜EST序列AM715537.2与之高度一致,据此设计引物经RT-PCR扩增、分子克隆和序列拼接,获得了黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因全长序列,命名为Cs6PGDH(GenBank登录号FJ610345)。序列分析表明,该基因全长1829bp,其中开放读码框(ORF)长1488bp编码495个氨基酸组成的多肽,编码区内无内含子存在,5′、3′端非翻译区长度各为70bp和271bp。Blast同源性分析显示该基因编码的氨基酸序列与拟南芥、大豆、水稻、玉米、菠菜等物种6PGDH基因有74%以上的一致性。由于与其他物种胞质6PGDH相类似氨基酸N端都缺少长度约为40aa的转运肽,推断Cs6PGDH为黄瓜胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因。

红麻6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PDGH)基因克隆及RNAi载体构建

【目的】克隆红麻不育系和保持系6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PDGH)基因,并构建其RNAi载体,为进一步研究其在红麻花药发育中的功能奠定基础。【方法】根据红麻花药转录组高通量测序数据结果和生物信息学方法获得6PDGH基因全长c DNA拼接序列,分别以红麻不育系(P3A)和保持系(P3B)的花药反转录c DNA及总DNA为模板克隆红麻6PGDH基因全长。依据RNAi载体设计原则,选取红麻6PGDH基因c DNA序列中段389 bp的特异片段做为RNA干扰片段,构建红麻6PGDH基因的RNAi载体。【结果】克隆获得的红麻不育系(P3A)和保持系(P3B)花药6PGDH基因全长均为1751 bp,均包含1458 bp的开放阅读框,编码485个氨基酸残基,无内含子;其碱基序列在不育系和保持系中仅存在两个碱基差异。该基因氨基酸序列(Gen Bank登录号KF964027)与拟南芥、玉米、大豆、苜蓿、三角叶杨、蓖麻的6PDGH同源性分别为75.07%、84.57%、86.50%、87.24%、91.19%和92.01%。成功构建了红麻6PGDH基因的RNAi载体,获得了干扰表达载体p ART27-p KANNIBAL-R1+2。【结论】成功克隆获得红麻6PGDH基因全长序列,构建的干扰表达载体可用于红麻6PGDH基因的功能研究。

草菇6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因可变剪接体克隆与表达分析

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)是磷酸戊糖途径的限速酶,影响着细胞生命活动所需要的NADPH的产生.为揭示草菇菌丝生长的分子基础,通过克隆草菇6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因(6gpdh)的可变剪接体,测序后进行生物信息学分析,利用表达谱和qPCR测定了它们在同核体和异核体菌株的表达量.结果显示,草菇6gpdh序列全长2 315bp,含10个内含子,第6个内含子存在内含子保留的可变剪接.在同核体和异核体菌株中,内含子保留的可变剪接体表达量低,且菌株间没显著差异,而内含子被剪接的剪接体表达量高,且异核体菌株高于同核体菌株.两种可变剪接体具有6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶保守结构域和相似的三维结构.因此,初步分析两个可变剪切体是同工酶,内含子保留是组成型表达,表达量与菌丝生长快慢无关,内含子剪接是主效剪接方式,菌丝生长快的菌株表达量高,生长慢的菌株表达量低.

金针菇戊糖磷酸途径的关键基因表达分析

生物细胞主要依靠戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway,PPP)产生还原力,该途径也是细胞内各种单糖分子相互转变和不同结构糖分子合成的重要方式。PPP途径能够在生物的不同生长发育或代谢活动中发挥重要的作用。本研究基于金针菇单核体菌株W23基因组数据,使用KEGG数据库注释了与金针菇PPP途径相关的22个基因。进一步结合生物信息学分析手段,研究了两个限速酶:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase,G6PDH)与6-磷酸葡糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)基因结构,并利用金针菇不同发育时期的不同组织转录组数据,分析了这两个限速酶编码基因的表达模式。结果表明,两个基因编码蛋白均具有行使其功能的保守结构域,定位在细胞质中,包含多个磷酸化位点。G6PDH系统发育分析表明该基因较为保守,进化与物种分类地位相一致。基因g6pdh与6pgdh的表达量呈高度正相关(相关系数为0.99),两个基因在菌丝阶段的表达量均高于子实体阶段,并且在菌盖中表达量高于菌柄,显示了PPP途径在金针菇不同发育阶段的活跃程度。本研究能够为金针菇生长和发育过程研究提供理论参考。