96孔板药敏试验自动判读系统设计

目的探讨96孔板药敏试验自动判读系统的设计与开发。方法选用数字相机对96孔板进行图像采集,运用机器视觉技术进行图像识别,从而得到药敏试验判读结果。采用图像拼接技术,将96孔板分为8个区域,运用二维运动平台进行多次采集,既提高了图像的分辨率,也克服了图像畸变带来的判读误差。结果制作了96孔板药敏试验自动判读系统,判读准确率达到100%,判读用时为人工的1/4~1/3h,且实现判读结果自动统计存储。结论自动判读系统能提高96孔板药敏试验的精度和效率。

自动固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定人尿中15种防晒剂和防腐剂

本文建立了同时快速测定人尿液中15种防晒剂和防腐剂的高通量自动固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱测定方法(automatic SPE-UPLC-MS/MS).人尿液经β-葡萄糖醛酸酶过夜酶解后,以Waters HLB 96-well Plate(30 mg,30μm)为基础,使用全自动固相萃取装置进行前处理,经25%乙腈溶液淋洗,甲醇-乙腈溶液(V:V=1:1)洗脱,氮吹至近干,20%乙腈溶液复溶后,采用Waters Acquity BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)、二元梯度洗脱系统(流动相A为水,流动相B为乙腈)进行色谱分离.质谱方法采用多反应监测(MRM)模式、电喷雾电离负离子模式和稳定同位素内标法进行数据采集和定量分析.15种分析物在相应线性范围内的线性相关系数(r)均大于0.999,3个加标水平的加标回收率为89.1%-110%,日内和日间精密度分别为0.9%-13%和3.1%-14%,样本稳定性、提取液稳定性、上样周期稳定性和反复冻融稳定性的相对标准偏差均在10%之内.将本方法应用于300名志愿者随机尿液的测定,结果显示该人群尿液的主要检出成分为4种防腐剂,分别是羟苯甲酯(MP)、羟苯乙酯(EP)、羟苯丙酯(PP)和对氯间二甲苯酚(PCMX),检出率分别为100%、92%、82%和64%,中位浓度分别为11.5、0.53、0.65、2.09 ng·mL^(-1).综上,本方法可应用于人尿液中15种防晒剂和防腐剂的快速提取、净化和定量分析,具有操作简便、灵敏度高、效率高、人员友好和绿色环保等优势,适用于大批量样品的检测应用.

利用96孔板建立除草剂微量活体筛选方法初探

以马唐、稗草、反枝苋3种杂草为指示植物,采用96孔板建立了化合物除草活性微量活体筛选方法.从6种培养基中筛选出最适合3种指示杂草生长的Ⅰ号培养基,以传统盆栽法为对照,进行了96孔板苗前处理微量活体筛选方法(以下简称96孔板法)的研究.结果表明:96孔板法以指示杂草的株高受抑制情况作为评价指标较为合适;3种供试除草剂采用96孔板法对3种指示杂草所表现出的杀草活性要高于盆栽法;乙氧氟草醚、二甲戊灵、氟乐灵盆栽法的EC50和EC90值分别是96孔板法的1.44～21.47倍和1.47～32.84倍;采用96孔板法,乙氧氟草醚对马唐和反枝苋、二甲戊灵对稗草的活性最高,EC50值分别为0.79、0.73和0.45μg/mL,EC90值也分别只有3.13、1.72和1.36μg/mL.96孔板法达到了微量、敏感、节省时间和空间的要求,是发现先导化合物除草活性较适宜的微量活体筛选方法.

96孔板高通量筛选多杀菌素高产菌株的研究

考察了刺糖多孢菌在96孔板固体培养基和液体培养基中的生长情况,建立了96孔板高通量筛选多杀菌素高产菌株的方法。结果表明:96孔板三明治盖能同时满足过滤杂菌和刺糖多孢菌生长耗氧所需,刺糖多孢菌在96孔板固体培养基中的生长情况与传统斜面培养相当,种子培养最适种龄为60h,每孔发酵培养基装液量为0.4mL。与传统摇瓶发酵筛选平台相比,该方法能显著提高多杀菌素高产菌株的筛选效率。

96孔板法筛选抗黑曲霉性乳酸菌及抑菌机理研究

目的:筛选对黑曲霉具有良好拮抗作用的乳酸菌菌株。方法:采用96孔板法进行乳酸菌优良菌株的筛选。研究p H和温度等因素对抗菌特性的影响,利用气相测定菌株DL3无细胞上清液(CFS)中有机酸含量,研究抑菌活性物质;利用扫描电镜分析孢子细胞的完整性,研究抑菌机理。结果:从传统东北酸菜分离的乳酸菌中筛选对黑曲霉具有较强抑制作用的植物乳杆菌DL3,其抑菌率为92.28%。在p H2.5~6.5对黑曲霉具有抑菌活性,并具有良好的热稳定性,121℃处理30 min后抑菌率仅降低5.71%。经气相色谱分析表明菌株DL3 CFS中乳酸、乙酸、丙酸和苯乳酸含量分别为5.743、1.635、0.033、0.085μg/m L,乳酸和乙酸对黑曲霉的抑菌率分别为91.69%和92.04%,丙酸和苯乳酸均无抑菌作用,初步判断菌株DL3的抑菌活性物质为有机酸类。扫描电镜观察表明菌株DL3 CFS破坏了黑曲霉孢子的完整性,导致细胞膜溶解,胞内物质外泄。结论:菌株DL3 CFS中对黑曲霉的抑菌活性主要来自于乙酸和乳酸,可作为米面制品的乳酸菌生物防霉剂的出发菌株。

96孔板-PCR排除法筛选猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因

为了从猪蛔虫雌虫cDNA文库中筛选出猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因,本研究根据猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因的EST序列为模板设计引物,采用96孔板-PCR排除法对猪蛔虫雌虫cDNA文库进行筛选,并筛选出阳性克隆F993-G10-A10。测序结果表明,该基因序列长621bp,有完整的3'端。经BLAST分析,其推导的氨基酸序列与秀丽隐杆线虫(C.elegans)的卵黄蛋白原基因(Vit1、Vit2、Vit3、Vit4和Vit5)的氨基酸序列的一致性分别为35%、35%、34%、34%和35%,核苷酸序列相似性分别为55%、57%、54%、54%和53%。该阳性克隆的获得为该基因的深入研究奠定了基础。同时也证明了96孔-PCR排除法是一种高效、简便、低成本的筛选文库方法。

食源致病菌96微孔板DNA诊断芯片的研制及在一起食物中毒突发事件中的应用

目的研制能同时检测9种常见食源致病菌的96微孔板DNA诊断芯片。方法针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7(Stx1和Stx2)、志贺氏菌、产单核细胞李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌等9种最常见的食源性致病菌,首先选择合适的保守基因,设计种特异性的PCR引物(5'端标记生物素)和检测探针,通过参数优化建立一管多重PCR扩增体系;然后按5×5的阵列格式将探针点制到96微孔板的微孔内,通过条件优化建立稳定的PCR产物与固化探针的微孔杂交体系;采用链霉抗生物素蛋白碱性磷酸酶和化学显色底物NBT/BCIP来检测特异性的PCR杂交产物。结果20株标准菌株验证已建立的食源致病菌微孔板DNA诊断芯片,获得比较特异和稳定的实验结果。在一起食物中毒事件中,该芯片在采样后12h内检出金黄色葡萄球菌,与传统的细菌分离培养和生化鉴定的结果相符。结论本研究建立的新型食源致病菌96微孔板DNA诊断芯片具有快速、准确、自动化和高通量等特点,为快速应对食物中毒等突发公共卫生事件提供了非常有价值的检测技术。

96孔板高通量选育嗜线虫致病杆菌高产帕克素菌株

帕克素(pekingmycin)是嗜线虫致病杆菌北京变种Xenorhabdus nematophilus var.pekinense CB6菌株代谢产生的广谱抗生素。研究证明帕克素对马铃薯晚疫病和辣椒疫病均具有较好的田间控制效果。为了进一步提高帕克素产量,为实现产业化奠定基础,本文首次用96孔板高通量筛选技术进行了帕克素高产菌株的筛选。将原始菌株CB6用紫外、微波和亚硝基胍诱变后在96孔板固体培养基上培养72 h,35%甲醇浸提24 h,根据浸提液OD312紫外吸收值和抑菌圈直径筛选出10株活性较高的正突变株。但由于存在遗传不稳定现象,故对其中一株优良突变株90#(菌株编号为90)进行了二次累加诱变,经初筛和复筛,得到4株比出发菌株抑菌圈显著增加的突变株,较出发菌株抑菌圈直径提高了6.39%～11.94%。对其中的2株突变株进行了遗传稳定性测定,结果表明,连续培养6代后,突变株抑菌圈直径无显著变化,菌株特性能稳定遗传。

流式细胞仪MoFlo Astrios^(EQ)96孔板单细胞分选方法的条件优化

目的·优化流式细胞仪MoFlo Astrios EQ 96孔板单细胞分选方法,为单细胞技术的应用奠定基础。方法·通过对仪器精确调节及各项参数优化,采用不同孔径喷嘴、不同分选方式对32D、U937、iBMDM和293T共4种细胞进行单细胞分选,观察分选后单细胞孔数以及单细胞所形成克隆孔数。结果·在单细胞分选模式下,70、100μm喷嘴分选获得单细胞的孔数分别为83~91、87~93孔。分选后的单细胞经7~10 d培养后,70μm喷嘴分选获得的单细胞所形成克隆的孔数为36~58孔;100μm喷嘴条件下电荷式分选、"无电"直接分选获得的单细胞所形成克隆的孔数分别为53~78、69~81孔。结论·进行单细胞分选时,选择100μm喷嘴和"无电"直接分选方式可得到较好的细胞活性与较高的细胞克隆率。

利用96孔板和酿酒酵母生长圈复合筛选高产管囊酵母

野生酿酒酵母不能利用木糖作为碳源,但是可以利用乙醇作为碳源和能源。管囊酵母可以利用木糖生产乙醇。酿酒酵母可以利用管囊酵母生产的乙醇作为碳源。本研究将管囊酵母进行紫外诱变后,利用96孔板培养,选取OD值较高的孔进行酿酒酵母生长圈筛选。管囊酵母在木糖(5%)为唯一碳源的YNB培养基上生长并产生乙醇。产生的乙醇越多,指示菌酿酒酵母的生长圈相对越大。利用酿酒酵母生长圈法筛选的正变率为35.22%,筛出1株菌UV171,乙醇产量为10.7 g/L,比对照高25.9%,对菌株UV171进行稳定性实验,传至3代其产量稳定。

96孔板高通量选育产乙醇酵母

以巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris),安琪酵母(Angelyeast),酿酒酵母(Saccharo-mycescerevisiae)等4株菌为出发菌株,经过紫外诱变,96孔板高通量筛选出60株,复筛选出4株。最大乙醇产量提高到76.6g/L,糖醇转化率达到了0.488g/g。对上述4株菌进行耐乙醇性能驯化,发酵耐乙醇能力达到15%。

96孔板定位夹具及其进样装置设计

在很多自动化生物实验中,都需要用到96孔板来承载液体样本,然后进样装置吸取样本到后端组件去处理和分析。设计一种96孔板定位夹具来保证96孔试剂板安装方便并精确定位,进样装置通过高精度三维机构移动来实现96孔板每一个样本的精准吸取,并有效避免样本之间交叉污染。

2种圆形微孔板内部流场的CFD数值模拟

为改善96孔板传质率和剪切力低的情况,提出一种带挡板的96孔板模型。基于VOF模型和RNG k-ε模型结合建立了孔板内部的流体动力学模型,利用仿真软件FLUENT对其数值进行模拟。在不同转速下,对其气液交界面面积、气液比表面积、平均液膜传质系数和体积平均气液传质系数等传质相关系数和平均剪切应变率进行对比。模拟结果表明:在不同转速下,带挡板96孔板的体积平均传质系数和剪切应变率都要高于普通96孔板;并且考察了带挡板96孔板在特定转速下不同装液量对其传质性能的影响。模拟结果表明:随着装液量的增加带挡板96孔板的气液传质系数逐渐降低,得出66.56μL为最佳装液量。综上所述,带挡板96孔板有效提高了普通96孔板的传质性能,并为其提供了更好的剪切环境,为孔板的设计和优化提供了参考。

一种适用于高通量基因分型的水稻种子切片DNA制备技术

建立一种高质量、低成本的水稻种子切片DNA制备方法,用于育种群体的高通量基因分型。通过对比TPS法提取水稻叶片DNA及96孔板结合磁珠法提取切片种子DNA的纯度和浓度,进一步采用STARP(Semi-thermal asymmetric PCR)标记检测验证96孔板结合磁珠法提取水稻切片种子DNA的质量。结果表明:96孔板结合磁珠法提取水稻种子切片的DNA质量和纯度优于TPS法提取水稻叶片的DNA质量;STARP标记检测验证结果显示96孔板结合磁珠法提取水稻切片种子DNA可适用于GS3、Wx的STARP标记基因分型,其鉴定结果与测序结果一致。研究显示96孔板结合磁珠法可以从微量水稻种子切片中提出高回收率、高纯度、高完整度、无PCR抑制物的DNA用于高通量STATP法基因单倍型分析,可获得一种96孔板结合磁珠法提取DNA的高通量基因分型操作流程。

双果糖酐水解酶分子改造提升酶活性研究

双果糖酐水解酶(difructose anhydrideⅢhydrolase,DFA-Ⅲase)能将新型功能甜味剂双果糖酐转化为益生元菊二糖,然而DFA-Ⅲase酶活性较低,为了提高DFA-Ⅲase酶法合成菊二糖的能力,该研究对来源于Arthrobacter chlorophenolicus A6的双果糖酐水解酶AcDFA-Ⅲase进行分子改造。基于已有的AcDFA-Ⅲase的晶体结构,选择酶活性口袋上方loop区和活性口袋中的14个关键位点进行定点突变,得到17种DFA-Ⅲase突变体。利用96孔板作为高通量培养容器,结合DNS法快速测定酶活性,初筛得到一个酶活性提高的突变体D380A。用HPLC法测定分离纯化出的酶活性,验证结果表明其酶活性有显著提高,酶比活性是AcDFA-Ⅲase的162.3%。同源建模分析,380位天冬氨酸突变成丙氨酸后,loop环区域疏水性增强,保证了催化中心的疏水微环境,提高了酶的催化活性。该研究建立的高通量检测方法为DFA-Ⅲase的筛选以及菊二糖的大量生产奠定了基础。

高通量工艺开发在生物制药下游工艺中的应用

随着生物医药的快速发展,生物医药进入临床前的工艺开发和生产是候选药物进入临床开发的“关键路径”。众所周知在生物制药下游工艺开发过程中,早期的层析工艺开发是非常复杂和具有挑战性的,由于工艺开发和特性描述需要大量的资源,但项目前期澄清料液有限,无法完成大量的实验以确定操作参数,即使传统的缩小规模实验在项目推进和物料方面仍然是个巨大的挑战。现在一种以自动化操作的高通量工艺开发(HTPD)方法开始被运用于下游工艺开发中,这种方法不仅平行评估大量实验参数,还能全面且系统化的完成工艺设计及优化,同时HTPD方法也可用在后期申报的缩小模型验证及工艺表征中,可大大缩短药物进入临床及商业化的时间。本文主要介绍HTPD在下游工艺开发中常见的微型色谱柱及应用,并以Tecan高通量液体工作站为例介绍了HTPD开发应用及其放大案例。

香蕉果实SMART cDNA文库的构建及利用PCR方法筛选香蕉Actin2基因

利用SMART(switching mechanismat5’end of RNA transcript)技术,提取果实少量总RNA,经15-25轮LD-PCR扩增获得全长ds-cDNA,构建了海南主栽的食用香蕉巴西蕉(Musa AAA Group Cavendish)果实的cDNA文库。所构建的文库容量为5×106Pfuml-1,重组率93%。利用此cDNA文库,采用96孔板PCR法筛选香蕉Actin2基因,测序结果显示,序列全长1723bp,编码区长1134bp,编码378个氨基酸,与蝴蝶兰Actin2基因序列同源率达83%,已递交GenBank,接受号692696。

一种快速测定发酵液中ε-聚赖氨酸的方法

为了建立一种快速方便的ε-聚赖氨酸检测方法,该研究基于ε-聚赖氨酸与Dragendorff’s试剂的沉淀复合物可与硫脲产生显色反应,提出了一种利用分光光度计快速检测ε-聚赖氨酸的新方法。ε-聚赖氨酸含量与反应复合物吸光度在pH2.0-5.0,反应时间在45 min以内,具有较高的线性相关性。分光光度计测定波长为435nm。浓度在0-1.50 g/L,ε-聚赖氨酸工作曲线线性相关系数为R2=0.9999,RSD=3.63%,检出限为0.01 g/L。回收率为96.50%-100.53%。该方法相比于Itzhaki法具有较高的准确性。最后以该方法为依据建立了一种利用96孔板高通量快速检测ε-聚赖氨酸的方法。

快速cDNA文库筛选和淀粉合成酶基因的分离与鉴定

建立了一种以PCR为基础的快速筛选cDNA文库的方法。该方法利用 96孔板和一对特异的引物 ,逐级从cDNA文库筛选目标克隆 ,最终获得目标DNA片段。与同位素杂交筛选方法相比 ,该方法具有快速、简单、省时等优点 ,数日内即可完成目标片段的克隆 ;同时 ,还可极大地降低实验费用 ,且无需使用同位素。本文利用这一方法从水稻南粳37未成熟种子的cDNA文库筛选出了完整的水稻可溶性淀粉合酶基因cDNA序列。

超高效液相色谱-质谱定量测定全血中的13种苯二氮卓类安眠镇静药物

本文建立了一种全血样品中13种苯二氮卓类安眠镇静药物及其代谢产物地西泮、硝西泮、溴西泮、氟西泮、氯硝西泮、氟硝西泮、劳拉西泮、奥沙西泮、普拉西泮、替马西泮、7-氨基硝基西泮、7-氨基氟硝西泮和氯氮卓的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法。全血样品经过Ostro96孔磷脂过滤板提取,采用电喷雾离子源正离子（ESI＋）模式和多反应检测（MRM）模式进行质谱分析,13种化合物在0.2~20 ng/m L浓度范围内均获得良好的线性,该方法的提取回收率分布在65.2%~113.9%之间,最小检测限可达0.008~0.15ng/m L。本方法灵敏、简便、快速、高通量,适用于全血样本中痕量苯二氮卓类安眠镇静类药物的定性定量分析。