96孔板-PCR排除法筛选猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因

为了从猪蛔虫雌虫cDNA文库中筛选出猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因,本研究根据猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因的EST序列为模板设计引物,采用96孔板-PCR排除法对猪蛔虫雌虫cDNA文库进行筛选,并筛选出阳性克隆F993-G10-A10。测序结果表明,该基因序列长621bp,有完整的3'端。经BLAST分析,其推导的氨基酸序列与秀丽隐杆线虫(C.elegans)的卵黄蛋白原基因(Vit1、Vit2、Vit3、Vit4和Vit5)的氨基酸序列的一致性分别为35%、35%、34%、34%和35%,核苷酸序列相似性分别为55%、57%、54%、54%和53%。该阳性克隆的获得为该基因的深入研究奠定了基础。同时也证明了96孔-PCR排除法是一种高效、简便、低成本的筛选文库方法。

上海宏石SLAN96P荧光定量PCR仪性能验证

目的对上海宏石SLAN96P荧光定量PCR仪进行性能验证和评价。方法在本院检验科ISO15189实验室认可中对宏石SLAN96P荧光定量PCR仪的准确度、精密度、线性范围、生物参考区间进行验证。结果上海宏石SLAN96P荧光定量PCR仪的准确度、精密度、线性范围、生物参考区间均在厂家规定的范围内。结论宏石SLAN96P荧光定量PCR仪各项性能均符合规定要求,可用于临床基因扩增检验。

SLAN-96P型荧光定量PCR仪性能评价及其应用

目的评价SLAN-96P型荧光定量PCR仪（SLAN-96P）的主要性能指标及其应用价值。方法按照美国临床实验室标准化协会（CLSI）文件制定的评价标准,对40份临床血清标本、质控品和标准品进行乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）定量检测,评价该仪器的准确性、重复性、线性、灵敏度、A模块与B模块的可比性等指标。结果准确度的相对偏倚为0.2%-5.2%;重复性：批内变异系数（CV_（批内））为1.37%-2.75%,批间变异系数（CV_（批间））为1.52%-2.51%;灵敏度：SLAN-96P能检测的最低HBV-DNA浓度为10-2 IU/mL;线性：直线回归方程是Y=0.982 X＋0.094 8,相关系数（r）=0.999;A模块与B模块的可比性：A模块与B模块的检测结果差异无统计学意义（P〉0.05）,直线回归方程为Y=1.000 7 X＋0.012 4,r=0.994。结论 SLAN-96P型荧光定量PCR仪各项性能指标良好,SLAN-96P在病原微生物核酸检测方面具有高效、灵敏、快捷、定量的特点,具有很好的临床应用价值。

香蕉果实SMART cDNA文库的构建及利用PCR方法筛选香蕉Actin2基因

利用SMART(switching mechanismat5’end of RNA transcript)技术,提取果实少量总RNA,经15-25轮LD-PCR扩增获得全长ds-cDNA,构建了海南主栽的食用香蕉巴西蕉(Musa AAA Group Cavendish)果实的cDNA文库。所构建的文库容量为5×106Pfuml-1,重组率93%。利用此cDNA文库,采用96孔板PCR法筛选香蕉Actin2基因,测序结果显示,序列全长1723bp,编码区长1134bp,编码378个氨基酸,与蝴蝶兰Actin2基因序列同源率达83%,已递交GenBank,接受号692696。

前列腺癌miRNA表达谱及miR-96在氧化应激信号通路中的作用

【目的】检测miRNA在前列腺癌与正常前列腺组织的表达差异,并探讨表达异常的miRNA在前列腺癌发病中的作用。【方法】前列腺癌和正常前列腺组织样品(100 mg),Trizol法提取RNA,应用聚合酶链反应(PCR)芯片检测miRNA的表达;同时以250μmol/L的过氧化氢(H2O2)刺激前列腺癌PC-3细胞4 h,继续正常培养12 h。检测不同时间点细胞内活性氧(ROS)水平,以实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-96在各组细胞中的表达。【结果】与正常前列腺组织相比,前列腺癌组织中miR-144、miR-216a上调5.9倍,miR-96上调30.4倍,miR-488、miR-873下调到4.9%,差异有统计学意义(P<0.05)。PC-3细胞内ROS为RWPE-1细胞的5.2倍(P<0.05),miR-96在PC-3细胞中的表达为RWPE-1细胞的15.4倍(P<0.05)。H2O2刺激PC-3细胞1、4 h后,胞内ROS为对照组的4.3、6.4倍(P均<0.05),miR-96表达水平为对照组的10.2、18.9倍(P均<0.05);10、16 h组胞内ROS为对照组的2.5倍、1.2倍,miR-96表达水平为对照组的2.7、1.9倍(P均>0.05)。【结论】在前列腺癌组织中发现了若干有表达差异的miRNA;miR-96参与前列腺癌细胞的氧化应激信号途径,可能是防治前列腺癌的重要分子靶点。

Has-miRNA-96在宫颈癌组织中的表达及其临床意义

目的：探讨Has-miRNA-96（miR-96）在宫颈癌组织中的表达情况及其与临床病理特征间的关系。方法： 采用茎环Real time RT-PCR方法检测52例宫颈癌、28例正常宫颈组织中Has-miRNA-96的表达，分析Has-miRNA-96表达与宫颈癌常见的临床病理特征的关系。结果：Has-miRNA-96在宫颈癌组织中的相对表达量（127.045±235.424）高于正常宫颈组织（0.995±0.236），差异有统计学意义（P=0.000）；在中、低分化癌的表达（137.778±249.981）高于高分化癌中的表达（75.766±147.237），差异有统计学意义（P=0.005）；在腺癌中相对表达量为（196.213±172.519），明显高于鳞癌（110.576±246.910），（P=0.004）；临床Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期子宫颈癌患者组织中Has-miRNA-96表达水平分别为（22.614±25.828）、（122.493±78.043）、（672.902±476.169），Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ期、Ⅱ期（P=0.000、P=0.001），Ⅱ期高于Ⅰ期，差异有统计学意义（P=0.000）；有淋巴结转移组表达为（142.537±104.673）明显高于无淋巴结转移组（19.787±26.204，P=0.000）；浸润深度：≥1/2间质表达为（75.323±94.822），高于＜1/2间质者（27.449±49.728，P=0.025）；而与患者年龄无明显关系（P=0.385）。结论：Has-miRNA-96在宫颈癌组织中存在异常高表达, 提示其可能在宫颈癌的发生发展中发挥致癌基因的作用，并且与宫颈癌的演进及不良预后密切相关。

基于16SrDNA序列分析及特异PCR鉴定DVS中未知乳杆菌

目的:探讨EZAL-MY96直投式酸奶发酵剂(DVS)中未知乳杆菌的分子生物学鉴定方法。方法:采用显微观察初步鉴定,利用16SrDNA序列分析方法进一步鉴定,利用NCBI中BLAST数据库对测序结果进行比对,构建系统发育树进行分析,并对菌种进行特异PCR分析。结果:最终确定该未知乳杆菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus)。结论:基于16SrDNA序列分析及特异PCR结合的方法可以快速、准确地的鉴定出未知乳杆菌。

miR-96-5p在肝细胞癌根治术后早期复发患者中的表达及其临床意义

目的:探讨miR-96-5p在肝细胞癌根治术后复发患者中的表达及其临床意义。方法:从我院肝癌标本库中选取61例冻存的原发性肝细胞癌组织标本,根据筛选标准将其中33例归为早期复发组(根治术后1年内出现肝内复发病灶),28例为非早期复发组(术后超过2年未出现肝内复发病灶);运用实时荧光定量PCR验证miR-96-5p在两组肝细胞癌组织的表达水平。结果:miR-96-5p在早期复发组肝癌组织中表达明显下调[(0.634±0.783)vs.(5.182±11.321),P=0.043],其在肝癌组织中的表达与肝癌术后早期复发及肿瘤直径、脉管癌栓有关(P<0.05)。结论:miR-96-5p与肝癌根治术后早期复发密切相关,并极有可能成为肝癌早期复发的分子标记物,以及为未来肝癌靶向治疗提供有效的靶点。

miRNA-96、miRNA-183在非综合征型耳聋中的表达及关系

目的探讨非综合征型耳聋患者血浆中miRNA-96和miRNA-183的表达水平,揭示两种miRNA的改变是否与耳聋存在关系。方法选取2019年3月-2021年10月于浙江省温州市人民医院就诊的非综合征型耳聋患者30例为耳聋组,听力正常30例为正常组。利用实时荧光RT-PCR技术检测两组血浆中miRNA-96和miRNA-183的表达水平,并对30例耳聋患者基因突变位点进行统计分析。结果耳聋组miRNA-96与正常组相比表达水平差异有统计学意义(P<0.05),为表达下调;miRNA-183与正常组相比表达水平差异有统计学意义(P<0.01),也为表达下调。耳聋基因突变位点统计显示,本研究中30例最常见的突变位点为GJB2235delC,其次为SLC26A4 IVS 2-7 A>G。结论本研究显示非综合征型耳聋患者与正常人血浆含有的miRNA-96和miRNA-183表达存在差异,提示两种miRNA与听力损失有一定的相关性。

一种适用于高通量基因分型的水稻种子切片DNA制备技术

建立一种高质量、低成本的水稻种子切片DNA制备方法,用于育种群体的高通量基因分型。通过对比TPS法提取水稻叶片DNA及96孔板结合磁珠法提取切片种子DNA的纯度和浓度,进一步采用STARP(Semi-thermal asymmetric PCR)标记检测验证96孔板结合磁珠法提取水稻切片种子DNA的质量。结果表明:96孔板结合磁珠法提取水稻种子切片的DNA质量和纯度优于TPS法提取水稻叶片的DNA质量;STARP标记检测验证结果显示96孔板结合磁珠法提取水稻切片种子DNA可适用于GS3、Wx的STARP标记基因分型,其鉴定结果与测序结果一致。研究显示96孔板结合磁珠法可以从微量水稻种子切片中提出高回收率、高纯度、高完整度、无PCR抑制物的DNA用于高通量STATP法基因单倍型分析,可获得一种96孔板结合磁珠法提取DNA的高通量基因分型操作流程。

辣椒泛素交联酶cDNA的分离及其在UV-B作用下的表达分析

利用96孔板法从UV处理的辣椒叶片cDNA文库中分离获得了一个cDNA阳性克隆,其长度为678 bp,含有148个氨基酸的开放读码框,与马铃薯等其他植物的泛素交联酶基因有较高的同源性,命名为CaE21.荧光定量PCR分析表明CaE21基因在UV-B作用下转录表达水平降低;当UV-B照射停止后,其表达水平逐渐回升.推测该基因与辣椒适应UV-B照射胁迫有关.

辣椒Rop cDNA分离及其序列分析

从cDNA文库中分离获得1个cDNA阳性克隆,测序和序列分析结果表明,其长度为1 141 bp,含有1个长度为197 aa的开放读码框架,与烟草等植物的Rop有较高的同源性,该cDNA是从UV处理的辣椒cDNA文库中分离获得的,可能与辣椒适应UV辐射胁迫有关。该cDNA的分离为进一步研究其在辣椒适应UV辐射防御反应的分子机理研究奠定了重要的基础。

大白菜细胞质雄性不育的分子鉴定及序列分析

为了获得3种大白菜细胞质雄性不育系Ogu CMS,Pol CMS,CMS96和保持系间的多态性以及定位大白菜CMS96不育系所属的不育类型,利用设计的atp6,orf222单一和混合引物PCR扩增3组11份同核异质大白菜细胞质雄性不育系和保持系mtDNA。结果表明,atp6引物在大白菜Ogu CMS不育系扩增的200 bp片段为其特异带;orf222引物仅在大白菜Pol CMS和CMS96不育系有扩增产物,但二者有3点完全不同:大白菜Pol CMS不育系扩增产物为675bp,CMS96不育系扩增产物为669 bp,二者相差6个核苷酸,后者定名为大白菜CMS96-orf222。大白菜CMS96-orf222与甘蓝型油菜Nap CMS的nad5c基因和Nap-orf222基因同源性均为99%,E值为0.0;大白菜Pol CMS的675 bp序列具有ORF224开放阅读框,没有保守结构域,而大白菜CMS96的669 bp序列具有ORF222开放阅读框和保守结构域YMF19。另外,atp6和orf222混合引物多重PCR扩增产物存在明显多态性:800 bp为大白菜保持系的差异带型;2 300 bp和1 500 bp为大白菜Pol CMS不育系特异带型;200 bp为大白菜Ogu CMS不育系特异带型;690 bp为大白菜CMS96不育系特异带型。该方法仅用一次PCR反应快速地将3种大白菜细胞质雄性不育系和保持系一次性全部区分开,为大白菜分子育种和常规育种更好地相结合提供了简单、快速、准确和重复性好的方法和手段。

快速cDNA文库筛选和淀粉合成酶基因的分离与鉴定

建立了一种以PCR为基础的快速筛选cDNA文库的方法。该方法利用 96孔板和一对特异的引物 ,逐级从cDNA文库筛选目标克隆 ,最终获得目标DNA片段。与同位素杂交筛选方法相比 ,该方法具有快速、简单、省时等优点 ,数日内即可完成目标片段的克隆 ;同时 ,还可极大地降低实验费用 ,且无需使用同位素。本文利用这一方法从水稻南粳37未成熟种子的cDNA文库筛选出了完整的水稻可溶性淀粉合酶基因cDNA序列。

96孔板格式PCR仪

7900HT Fast Real-Time PCR可以在35分钟完成96孔板的PCR反应。缩短了加热循环时间，增加了研究人员的工作效率。这套系统包括一个让使用者可以互换的Fast PCR循环模块，一个qMan Fast Universal PCR Master Mix主机和Optical 96-Well Fast Thermal Cycling Hates快速热循环板。