AOC-ipt转录融合基因转化热研5号柱花草

以无菌热研5号柱花草子叶为材料,采用农杆菌介导把AOC-ipt基因转录融合转化热研5号柱花草,通过10 mg/L的潮霉素筛选,获得约500余株抗性苗,通过PCR检测获得23株阳性苗,对这23株阳性苗进行RT-PCR检测,其中14株为阳性。对这14株转基因苗进行了抗盐性初步观察,转基因苗并没有明显地提高热研5号柱花草的抗盐能力。

四种技术平台检测甲状腺癌NTRK融合变异的比较

目的探讨免疫组化、DNA-based NGS、FISH和qRT-PCR四种技术平台检测甲状腺癌NTRK融合变异的一致性。方法对40例临床组织样本(其中31例为甲状腺癌样本)同时行FISH、免疫组化、DNA-based NGS和qRT-PCR法检测NTRK融合基因。结果四种技术平台均检测的31例甲状腺癌样本中,与FISH技术相比,免疫组化的敏感性、特异性、阳性预测值(positive predictive value,PPV)、阴性预测值(negative predictive value,NPV)和总符合率(total coincidence rate,TCR)分别为100%(9/9)、90.9%(20/22)、81.8%(9/11)、100%(20/20)、93.5%(29/31),其PPV较差;DNA-based NGS的敏感性、特异性、PPV、NPV和TCR分别为44.4%(4/9)、100%(22/22)、100%(4/4)、81.5%(22/27)、83.9%(26/31),其敏感性较差;qRT-PCR和FISH技术检测的一致性为100%(31/31)。与FISH技术相比,免疫组化、DNA-based NGS和qRT-PCR的Kappa值分别为0.853、0.532和1.000。在40例临床组织样本中,39例与FISH结果一致,仅1例(脂肪纤维瘤病样神经肿瘤)因检测范围未覆盖NTRK的少见融合类型(LMNA:exon4-NTRK1:exon10)qRT-PCR法未检出,基于RNA检测融合的qRT-PCR与FISH技术的符合率最高。结论基于RNA的qRT-PCR技术具有敏感性高、特异性高,操作便捷、判读简易的特性,可能是适用于病理科常规临床检测甲状腺癌NTRK融合变异的优选方案。

IRF2BP2及融合基因在实体肿瘤发生发展中作用的研究进展

干扰素调节因子2结合蛋白2(IRF2BP2)作为新型转录调节因子,是干扰素调节因子2结合蛋白(IRF2BP)转录调节家族中的重要成员之一。IRF2BP2广泛存在于不同生物体中,充当着正负反馈调节器的角色,参与细胞功能的调节,如细胞凋亡、细胞增殖、细胞免疫等,从而调节肿瘤微环境,影响着肿瘤的发生发展。同时,IRF2BP2基因还可以和其他类型基因发生基因融合,成为IRF2BP2/NTRK1、IRF2BP2/CDX1、IRF2BP2/RARA等,共同影响肿瘤的发生发展。

成人和儿童ALL7种常见融合基因表达的比较

目的:比较成人和儿童ALL7种常见融合基因表达的差异。方法:利用RT-PCR技术检测7种常见融合基因。结果:在233例成人ALL中62例融合基因检测阳性,其中BCR/ABL31例,MLL相关19例,E2A/PBX1、SIL/TAL1各5例,SET/CAN、TLS/ERG各1例,未检出TEL/AML1阳性病例;在215例初诊儿童ALL中35例检测阳性,其中BCR/ABL3例,E2A/PBX18例,MLL相关11例,SIL/TAL15例,TEL/AML16例,TLS/ERG2例,未检出SET/CAN阳性病例。成人ALL中BCR/ABL最为常见,而在儿童ALL中表达较低,差异有统计学意义(P<0.01),MLL相关融合基因、E2A/PBX1、SIL/TAL1、TEL/AML1、SET/CAN、TLS/ERG等在成人和儿童表达差异不显著。结论:成人和儿童ALL融合基因表达各有侧重,在初诊时进行快速检测可进行较为准确的分型。

成人Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌超声表现

Xpl1.2易位/转录因子E3基因融合相关性肾癌(renal cell carcinoma associated with Xpl1.2 translocation/transcription factor E3 gene fusions,TRCC Xp11.2)于1991年由TOMLINSON等[1]首次报道,2013年世界泌尿病理学会(International Society of Urological Pathology,ISUP)将其归入小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)家族易位相关性肾细胞癌[2-3]。本研究回顾性分析经术后病理证实的3例成人TRCC Xp11.2的常规超声及超声造影(contrast-enhanced ultrasound,CEUS)表现。

bcr/abl融合基因阳性急性淋巴细胞白血病的临床特点

目的总结bcr/abl融合基因阳性急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿临床特点,探讨其治疗及预后的相关因素。方法对经巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测bcr/abl融合基因阳性ALL患儿临床表现、治疗、预后进行回顾性分析。结果bcr/abl融合基因阳性ALL患儿20例。中位年龄9岁,普通B细胞型ALL 19例(95%);治疗d33骨髓完全缓解率为66.7%,16例中7例复发(45%),持续缓解时间2年以上6例;5例接受造血干细胞移植(HSCT),均骨髓复发;6例存活患者中均为单纯化疗,bcr/abl融合基因已转阴。1例T细胞表型患儿于化疗缓解3个月骨髓复发,接受移植术后1个月骨髓再次复发。结论bcr/abl融合基因阳性ALL患儿化疗效果差,难缓解,复发率高,预后差,T细胞表型预后更差。部分对化疗敏感的患儿bcr/abl融合基因持续阴性。异基因HSCT复发率也较高。

粘液样脂肪肉瘤TLS/FUS-CHOP融合基因的检测

目的:探讨在粘液样脂肪肉瘤石蜡包埋组织中检测TLS/FUS-CHOP特异性融合基因的可行性及TLS/FUS-CHOP融合基因表达在粘液样脂肪肉瘤诊断中的价值。方法:收集粘液样脂肪肉瘤石蜡包埋组织标本6例,以粘液样脂肪瘤、脂肪母细胞瘤、粘液瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、粘液纤维肉瘤作为阴性对照,茁-肌动蛋白和茁2-微球蛋白作为内对照,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和巢式PCR检测TLS/FUS-CHOP融合基因的表达。结果:6例粘液样脂肪肉瘤中4例检出茁-肌动蛋白mRNA表达,5例检出茁2-微球蛋白mRNA表达,其中3例检出II型TLS/FUS-CHOP融合基因mRNA表达。对照组均未检出TLS/FUS-CHOP融合基因的表达。结论:运用RT-PCR方法检测石蜡包埋组织中TLS/FUS-CHOP融合基因mRNA的表达可行,有助于粘液样脂肪肉瘤的诊断和鉴别诊断。

E2A-PBX1融合基因阳性的儿童急性淋巴细胞白血病携带变异型融合转录本

为了研究儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)中E2A-PBX1融合基因的表达,采用位于E2A基因不同位置的上游引物与下游PBX1引物,检测了410例儿童ALL,包括362例B细胞ALL和48例T细胞ALL。结果发现:17例患儿携带E2A-PBX1融合基因,检出率4.1%,且全部为B细胞ALL,而且所有阳性病例均表达一种变异型融合转录本,后者是由E2A基因的第13外显子(159bp)被差异剪切形成的。经BLASTn比对分析,这种转录本保持了原来的开放阅读框,但导致53个氨基酸残基的丢失。这53个氨基酸残基位于活化区2,会导致融合蛋白中部分环-螺旋结构以及全部七聚体亮氨酸重复序列的丢失。结论:携带E2A-PBX1融合基因的儿童ALL表达典型和变异型2种融合转录本,后者是由E2A基因第13外显子被差异剪切而形成的,它将导致融合蛋白中53个氨基酸残基及其所构成的部分环-螺旋结构以及全部七聚体亮氨酸重复序列的丢失。

人ID4基因启动子及上游顺式表达调控元件的克隆及特征分析

目的克隆人ID4基因启动子及上游顺式调控元件,并对其结构及调控元件的特征进行生物信息学分析。方法从NCBI人类基因组数据库中截取ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列。利用TESS和Genomax等在线分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析。设计PCR引物,采用分段扩增法,获得长度分别为1811bp和650bp的两条产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至Top10感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆。先后应用KpnⅠ/NheⅠ、KpnⅠ/EcoRⅠ对获得的两个pGEM-T重组载体及pGL3Basic荧光素酶报告载体进行双酶切,T4DNA连接酶连接,转化至Top10感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,最后测序鉴定。结果获得长度为2461bp的ID4基因启动子DNA序列,经测序证实与人类基因组序列一致。ID4基因具有Ⅱ型启动子特征,有2个非常显著的上游元件(TATA盒和GC盒),GC含量占总碱基含量的65.9%。在转录起始位点上游-1000bp与下游212bp之间分别存在多个可能具有正向和负向调控作用的顺式元件。结论成功克隆了人ID4基因启动子及其顺式调控元件,并证明ID4基因具有典型的Ⅱ型启动子结构。筛选出3个最有可能对ID4表达起调控作用的顺式元件,分别为糖皮质激素受体、单磷酸腺苷(cAMP)结合蛋白受体及雌激素受体。

应用多重套式RT-PCR检测儿童急性淋巴细胞白血病的融合基因

目的 研究染色体结构易位所致的融合基因在儿童急性淋巴细胞白血病 (ALL)的表达。方法 采用多重套式RT PCR结合染色体R带或G带核型分析、流式细胞仪细胞免疫表型检测对 64例儿童ALL进行分析。结果 64例ALL患儿中 23例(36. 0% )具有 13种染色体畸变产生的融合基因,包括E2A/PBX1,E2A/HLF,TEL/AML1,TLS/ERG,MLL/AF4,MLL/AF9,MLL/AF10,MLL/AFX,MLL/AF6,MLL/ELL,dupMLL,TAL1D,HOX11。ALL患儿融合基因和染色体总畸变率为 67. 2%(43 /64)。结论 多重套式RT PCR结合染色体核型、免疫表型是儿童ALL临床诊断、治疗和预后判断的重要依据。

bcr/abl融合转录子阳性的B细胞型急性淋巴细胞白血病免疫表型特点

为探讨B细胞型急性淋巴细胞白血病 (B ALL)中bcr/abl融合转录子阳性白血病细胞的生物学特征 ,用流式细胞术检测 2 6例bcr/abl阳性及 32例bcr/abl阴性B ALL病例的免疫表型 ,用PCR法检测免疫球蛋白重链(IgH)基因重排。结果表明 :所有的病例均为CD19阳性。bcr/abl阳性与bcr/abl阴性B ALL表面分子有显著统计学差异 (P <0 .0 5 )的是CD34(96 .2 %与 6 5 .6 % ) ,CD10 (96 .2 %与 71.8% )及CD38(43.8%与 95 .4 % )。在 2 6例bcr/abl阳性病例中 ,原始细胞共表达CD10 + /CD19+ /CD34+ ,CD10 + /CD34+ /HLA DR+ 和CD10 + /CD34+ /CD38-分别为 92 .3% (2 4 / 2 6 ) ,73 1% (19/ 2 6 )和 5 6 .2 % (9/ 16 )。对bcr/abl阳性组的 17例进行了IgH基因重排检测 ,10例阳性 (5 8.8% )。 14例bcr/abl阴性组中 12例 (85 .7% )阳性。在 32例bcr/abl阴性病例中 ,原始细胞共表达CD10 + /CD19+ /CD34+ 和CD10 + /CD34+ /HLA DR+ 分别为 4 3.8% (14 / 32 )和 37.5 % (12 / 32 ) ,无 1例表型为CD10 + /CD34+ /CD38-。结论 :bcr/abl阳性B ALL患者CD34和CD10阳性率较高 ,而CD38阳性率较低 ,且IgH基因重排检出率较低 ,其独特的免疫表型特征是CD10 + /CD34+ /CD38-。

急性淋巴细胞白血病bcr/abl融合基因表达及其与免疫表型的关系

采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了M-bcr/abl和m-bcr/abl两种类型融合基因在48例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的表达,并且绝大多数病例同时进行了免疫表型和DNA倍体的流式细胞术分析。结果表明,25%(12/48)的病例M-bcr/abl或m-bcr/abl融合基因阳性,m-bcr/abl阳性率略高。分析bcr/abl阳性病例的免疫表型,发现大多数病例为B系标志阳性,但部分T系标志阳性的病例也检测出M-bcr/abl或m-bcr/abl,说明bcr/abl阳性ALL病例以B系标志阳性者居多,T系标志阳性的ALL病例也可为bcr/abl阳性。

初发慢性髓系白血病bcr/abl融合基因转录子与临床关系的观察

目的 研究初发慢性髓系白血病bcr/abl融合基因转录子类型与临床关系。方法 使用RT PCR对 5 1例初发CML患者进行bcr/abl融合基因转录子检测。结果 b3a2型患者血小板数高于b2a2型患者 ,但b3a2型患者WBC数低于b2a2型患者 (P <0 .0 5 ) ;血红蛋白浓度与b2a2型患者比较无差异 (P >0 .0 5 ) ;b3a2型和b2a2型患者比较AKP和Ph1染色体比例无差异 (P >0 .0 5 ) ;M bcr/abl阳性患者伴m bcr/abl阳性率为 47 0 % ,其中b3a2型患者有m bcr/abl融合基因转录子 14例 ,b2a2型患者有 10例。结论 b3a2型CML患者初发时更易有血小板升高表现 ,但b2a2型患者更易有WBC数升高的表现 ,较多的初发CML患者同时伴有m bcr/abl阳性。

应用实时定量PCR技术检测慢性粒细胞白血病患者bcr/abl^(P190)融合基因转录本

目的研究bcr/ablP190融合基因转录本在慢性粒细胞白血病(CML)中表达水平及其临床相关性。方法应用实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测74例CML患者骨髓单个核细胞中的bcr/ablP190转录本。结果bcr/ablP190转录本阳性54例(77.1%),中位含量2.60(1.08~8.58)×10-3,与性别、年龄、白细胞总数、血红蛋白含量、血小板计数、bcr/ablP210转录本类型和表达水平均不相关,但bcr/ablP190阳性患者的白细胞总数和血小板计数较阴性者明显降低。bcr/ablP190转录本水平在急变期与慢性期患者以及不同类型急变患者中都无差异,而细胞遗传学完全缓解患者的bcr/ablP190水平较慢性期患者、干扰素无效患者和急变期患者则明显下降。结论不同阶段CML患者体内大都存在着不同的bcr/abl剪切型转录本,不同剪切型的存在具有一定的血液学相关性。

联合检测AML1-ETO及其9a异构体在微小残留白血病监测中的意义

目的研究AMLl-ET0及其9a异构体在急性髓系白血病M2型中治疗前后及复发时的表达水平的变化,探讨其对微小残留白血病监测的意义。方法选择2010年1月至2014年1月46例急性髓系白血病患者为研究对象,均经联合化疗获得完全缓解,骨髓采集时间在初诊时、诱导化疗结束时、随访每6个月检测1次以及复发时,随访时间为3年。利用RQPCR方法监测AML1-ETO及9a异构体融合基因的表达水平,总结分析两者的表达水平与临床参数之间的相关性。结果在46例确诊伴有t (8;21)的AML-M2患者的骨髓标本中有41例检测到AE9a异构体,占89.13%。21例复发患者均检测到AE9a异构体;41例AE及AE9a均阳性患者,21例复发,20例未复发,复发组平均表达水平高于未复发组,并且两组对比,AE9a比AE高的更明显(P<0.01);经化疗获完全缓解后,AE、AE9a表达水平均下降,但复发组下降的百分比低于未复发组,差异有统计学意义(P<0.05);比较复发组AE、AE9a化疗前后的变化发现,AE下降的水平明显高于AE9a (P<0.01);缓解期间,21例复发患者中14例AE9a在AE表达低水平时即出现升高甚至异常升高。结论 AE9a与AE共表达于伴有t (8;21)的AML-M2患者中,AE9a异构体对标准化疗的敏感性较AE差。作为微小残留白血病的监测,同时检测AE及AE9a两者表达水平的变化比单独检测AE融合基因能更早地预示疾病复发趋势,从而可提前进行临床干预,降低患者的复发率,提高患者的长期生存率。

多重RT-PCR联合毛细管电泳法检测BCR-ABL融合基因

目的：建立多重逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）联合毛细管电泳法检测BCR-ABL融合基因，以期应用于慢性粒细胞白血病（CML）辅助诊断。方法采用重叠延伸法构建BCR-ABL融合基因阳性模板，设计并优化检测BCR-ABL融合基因的多重RT-PCR联合毛细管电泳体系，对检测体系进行初步的性能评估。结果多重RT-PCR技术检测BCR-ABL融合基因（e1a2、e13a2和e14a2）的最低检测限在102～103拷贝/μL；50例临床确诊CML的患者应用该法检测BCR-ABL融合基因的阳性率为86．0％，其中e13a2型（20．0％），e14a2型（66．0％）；本方法与骨髓细胞培养染色体核型分析相比，阳性符合率为97．6％，阴性符合率为75．0％，总符合率为94．0％，2种方法具有较高的一致性（Kappa＝0．765，P＞0．05）。结论成功建立检测BCR-ABL融合基因的多重RT-PCR联合毛细管电泳方法。该方法操作简单快捷、特异性好、灵敏度高，适合于临床上CML的辅助诊断和分子分型。

不同方法筛检非小细胞肺癌中EML4-ALK融合基因的研究

1 文献来源 研究一： Takeuchi K, Choi YL, Soda M, et al. Multiplex reverse transcription-PCR screening for EMIA-ALK fusion transcripts [J]. Clin Cancer Res, 2008,14（20） ：6618-6624.

建立实时荧光定量逆转录PCR方法检测非小细胞肺癌棘皮动物微管相关蛋白4-间变淋巴瘤激酶融合基因

目的建立一种实时荧光定量逆转录PCR方法,对非小细胞肺癌间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因进行快速、敏感和特异检测。方法首先,应用Primer Premier 5.0软件,针对棘皮动物微管相关蛋白4(EML4)-ALK常见融合变异V1、V2、V3a和V3b设计引物和Taqman水解探针。然后,以包含EML4-ALK融合变异V1、V2、V3a和V3b的假病毒颗粒为研究对象,进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性和特异性。最后,用所建立的方法检测50例非小细胞肺癌临床标本,其中包含3例ALK-荧光原位杂交(FISH)(+)样本。结果在无背景RNA干扰情况下,建立的实时荧光定量逆转录PCR方法检测灵敏度高达10拷贝/!l。在500拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达1%,在5000拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达0.5%。对于检测特异性,以正常人白细胞及血浆RNA为研究对象,均未见非特异性扩增。对50例非小细胞肺癌临床标本进行检测,47例阴性标本检测均为阴性,3例ALK-FISH(+)标本2例检测阳性,1例未检出,未检出原因与标本RNA提取失败有关。结论本研究建立的实时荧光定量逆转录PCR方法是一种快速、简便以及具有高灵敏度和特异性的EML4-ALK融合基因检测方法,值得在临床进一步验证和推广。

非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因1型的表达研究

目的:检测广西非小细胞肺癌癌组织中EML4-ALK融合基因1型的表达水平并探讨其临床意义。方法:运用两步法RT-PCR技术。检测来自于我院81例非小细胞肺癌癌组织和17例支气管扩张或肺大疱等手术切除的非癌肺组织中EML4-ALK融合基因1型的表达水平。结果:81例非小细胞肺癌癌组织和17例非癌肺组织中分别检测出26例(32.10%)和14例(82.35%)EML4基因表达阳性,全部标本中EML4-ALK融合基因1型表达阴性。结论:在广西非小细胞肺癌患者癌组织标本中未检测出EML4-ALK融合基因1型的表达,可能是EML4-ALK融合基因1型在非小细胞肺癌中的表达具有区域异质性。

急性T细胞白血病细胞变异型sil-tal1融合转录本和基因组DNA断裂点

本研究探究1例儿童急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)的变异型sil-tal1融合转录本的序列。将PCR扩增产物克隆入质粒载体并测序,针对变异部分序列设计引物,对基因组DNA进行PCR扩增及序列比对。结果表明,在cDNA水平发现4种不同的融合转录本,分别保留了sil基因的部分外显子或内含子序列,并存在插入和删除现象。经分析白血病细胞的基因组DNA序列,发现了一种新的sil-tal1重组,其sil基因的断裂点在DNA水平上与文献报道不同。结论:此例患儿白血病细胞的tal1基因发生了新型重组,并表达经典型的和至少3种变异型的融合转录本,此现象可能是由于白血病细胞转录剪接机制异常所致。