Exendin-4改善Aβ31-35所致小鼠海马HT22神经细胞Per2节律基因/蛋白异常表达

目的探讨Exendin-4对β淀粉样蛋白31-35(Aβ31-35)所致HT22细胞Per2节律基因/蛋白表达的影响及机制。方法 HT22细胞分为Aβ31-35处理组(0,2.5,5.0,10.0μmol/L),Exendin-4单独处理组,Exendin-4预处理组,Exendin-4+Exendin(9-39)预处理组,Exendin-4+Exendin(9-39)处理组,Exendin(9-39)单独处理组,以完全培养基培养的细胞为对照组。光镜下观察HT22细胞形态,MTT法检测细胞存活率,实时荧光定量PCR检测Per2基因的表达,免疫荧光染色观察GLP-1R及PER2蛋白表达。结果 5,10μmol/L Aβ31-35处理后,细胞存活率较对照组显著降低(P<0.05)。Exendin-4预处理后,5μmol/L Aβ31-35引起的细胞形态结构的改变明显改善,细胞存活率显著提高(P<0.05)。Exendin-4预处理后,Per2基因/蛋白表达在CT(circadian time)16时较Aβ31-35处理显著提高(P<0.05);Exendin-4+Exendin(9-39)处理后,GLP-1R表达在CT16时较Exendin-4处理显著降低(P<0.05)。Exendin-4+Exendin(9-39)预处理后,CT16时PER2蛋白荧光强度较Exendin-4预处理显著降低(P<0.05)。结论Exendin-4可能通过上调GLP-1R,改善Aβ31-35所致HT22细胞Per2节律基因/蛋白异常表达。

Aβ31-35和ApoE4对体外大鼠基底前脑神经元存活和生长的协同作用

目的 探讨 β-淀粉样蛋白 (Aβ)和载脂蛋白 (Apo E4)对基底前脑神经元存活和生长的影响 ,研究Alzheimer病 (AD)发病的细胞分子机制。 方法 体外培养基底前脑神经细胞 ,MTT法和免疫细胞化学方法结合体视学分析 ,观察 Aβ31- 35和 Apo E4对基底前脑神经元存活及胞体和突起生长的影响。 结果 (1) MTT法测得的 Aβ- 31- 35 +Apo E4组的 A值 ,与对照组比较明显减小 (P<0 .0 5 ) ,说明神经元的存活力降低 ,存活数量减少 ;(2 )Aβ31- 35 +Apo E4组的神经元胞体最长径和最短径明显低于对照组和 Apo E4组 (P<0 .0 5 ) ;平均突起长度也明显低于对照组、Apo E4组和 Aβ31- 35 (10 μmol/ L)组 (P<0 .0 1) ;(3) Aβ31- 35 (2 0 μm ol/ L)组平均突起长度比对照组、Apo E4组和 Aβ31- 35 (10 μmol/ L)组明显减小 (P<0 .0 1) ;(4) Aβ31- 35 +Apo E4组和 Aβ31- 35 (2 0 μm ol/ L)组的胆碱能神经元最长突起长度、总突起长度及平均突起长度均明显低于对照组 (P<0 .0 1) ;且这两组的 Ch AT阳性神经元的胞体平均灰度也明显低于对照组 (P<0 .0 5 ) ,说明 Ch AT的活性下降。单独 Apo E4对基底前脑神经元的存活和生长均无明显影响。 结论 Aβ31- 35 +Apo E4比单独 Aβ31-

炎症反应在S14G-Humanin拮抗Aβ31-35所致大鼠行为学改变中的作用

目的:以小胶质细胞形态和功能的改变为观察指标,探究炎症反应在S14G-Humanin(HNG)拮抗Aβ31-35所致大鼠行为学改变中的神经保护作用。方法:SD大鼠60只随机分为5组,经侧脑室分别注入生理盐水(对照组)、Aβ31-35(Aβ31-35组)、Aβ31-35+HNG(0.01 mmol/L)、Aβ31-35+HNG(0.1 mmol/L)、Aβ31-35+HNG(1 mmol/L)。注射第7 d行Morris水迷宫实验观察各组大鼠的行为学改变;注射12 d后处死大鼠,运用免疫组化法检测海马及皮层的激活小胶质细胞的数量,采用ELISA法检测大鼠海马及皮层组织IL-6的含量。结果:与对照组相比,Aβ31-35组大鼠的学习、记忆能力明显下降(P<0.05),Aβ31-35+HNG(0.1,1 mmol/L)组大鼠的学习、记忆能力有所改善,与Aβ31-35组相比差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,Aβ31-35组的激活小胶质细胞数及IL-6的含量在皮层及海马组织中均增加(P<0.05);与Aβ31-35组相比,Aβ31-35+HNG(0.01,0.1,1 mmol/L)组皮层及海马的激活小胶质细胞数及IL-6的含量均减少(P<0.05)。结论:S14G-Humanin对Aβ31-35诱导的大鼠行为学改变具有保护作用,而抑制Aβ31-35诱导的小胶质细胞激活产生的炎症反应可能是HNG拮抗Aβ神经毒的机理之一。

D-Ser2-Oxyntomodulin改善Aβ31-35所致小鼠昼夜节律紊乱

目的:观察胃泌酸调节素类似物D-Ser2-Oxyntomodulin(Oxy)是否可以改善β淀粉样蛋白31-35(Aβ31-35)所致的小鼠昼夜节律紊乱,探讨Oxy改善Aβ31-35所致昼夜节律紊乱的细胞分子机制。方法:(1)选取6~8周龄C57BL/6雄性小鼠进行跑轮行为学实验,分析Oxy改善Aβ31-35所致小鼠昼夜节律紊乱的作用。(2)选取小鼠海马HT22神经细胞,CCK8法检测细胞存活率,Real-time PCR检测不同时间点钟基因Bmal1和Per2 mRNA的变化趋势,Western Blot分别检测CT20时Bmal1蛋白和CT16时Per2蛋白的表达情况。结果:(1)Aβ31-35引起小鼠昼夜节律紊乱,与对照组相比,自由运转周期显著延长。Oxy预处理再给予Aβ31-35后小鼠的昼夜节律紊乱情况有所改善,与Aβ单独给予相比,自由运转周期显著降低。(2)Aβ31-35引起HT22细胞存活率显著降低,Oxy预处理后有效逆转Aβ31-35诱导的细胞存活率下降,且具有剂量依赖性。(3)经Aβ31-35处理后,HT22细胞的Bmal1和Per2 mRNA水平分别在CT20和CT16较对照组明显降低;而Oxy预处理组Bmal1和Per2的异常表达均得到显著改善。(4)与对照组相比,Aβ31-35组CT20时Bmal1和CT16时Per2蛋白水平显著降低;而与Aβ31-35组相比,Oxy预处理组Bmal1和Per2蛋白水平有所升高。结论:Oxy可能通过调整Bmal1和Per2的表达改善Aβ31-35所致C57BL/6小鼠昼夜节律紊乱。

Exendin-4通过拮抗钙超载改善Aβ_(31-35)诱导的HT22海马神经细胞per1基因异常表达

目的:探讨Exendin-4对Aβ_(31-35)所致的HT22神经细胞per1基因异常表达的影响及可能作用机制。方法:本研究采用海马神经细胞HT22作为实验对象。以1%血清饥饿1 h来诱导细胞同步化(CT0)。MTT实验检测细胞存活率;倒置显微镜下观察细胞形态变化;Real-time PCR检测各CT时间per1基因的表达变化;选择per1表达差异最显著的CT时间点,采用流式细胞术检测细胞内钙离子浓度的变化情况。结果:(1)Exendin-4可以明显提高Aβ_(31-35)所致的HT22细胞存活率的下降;(2)镜下观察可见,经Exendin-4预处理后部分改善了Aβ_(31-35)对细胞的损伤作用,细胞形态有所恢复;(3)Aβ_(31-35)使per1基因在CT16时各处理组的相对表达量明显不同;与对照组相比,Aβ_(31-35)使per1基因表达量明显升高;经Exendin-4预处理后,per1基因的表达得到一定程度的恢复,差异具有统计学意义;(4)在CT16时各处理组细胞荧光强度值明显不同,与对照组相比,Aβ_(31-35)使细胞荧光强度明显增强;经Exendin-4预处理后,细胞荧光强度值明显降低,差异具有统计学意义,此结果与加入尼莫地平的结果类似。加入尼莫地平预处理后,检测各个CT时间per1基因表达变化,与Exendin-4预处理组得到的结果类似。结论:Exendin-4通过拮抗钙超载改善Aβ_(31-35)诱导的HT22海马神经细胞per1基因的异常表达。

S14G-Humanin对Aβ_(31-35)所致大鼠行为学及神经元凋亡的影响

目的:研究S14G-Humanin对Aβ31-35所致大鼠行为学及神经元凋亡的影响。方法:SD大鼠60只随机分为5组,经侧脑室分别注入生理盐水(对照组)、Aβ31-35(Aβ31-35组),Aβ31-35+HNG(0.01 mmol/L),Aβ31-35+HNG(0.1 mmol/L)和Aβ31-35+HNG(1 mmol/L)。注射第7 d行Morris水迷宫实验观察各组大鼠的行为学改变;注射12 d后处死大鼠,应用TUNEL法检测各组海马神经元的凋亡情况,应用免疫组化法检测神经元caspase-3的表达。结果:与对照组相比,Aβ31-35组大鼠的学习、记忆能力明显下降(P<0.05),Aβ31-35+HNG(0.1,1 mmol/L)组大鼠的学习、记忆能力有所改善,与Aβ31-35组相比差异有统计学意义(P<0.05)。Aβ31-35组海马神经元的凋亡指数及caspase-3阳性细胞数均高于正常对照组,Aβ31-35能引起大鼠海马神经元的凋亡及学习、记忆能力的下降;Aβ31-35+HNG(1,0.1,0.01 mmol/L)组凋亡指数及caspase-3阳性细胞数均明显下降,与Aβ31-35组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:S14G-Humanin对Aβ31-35诱导的大鼠海马神经元凋亡及行为学改变具有保护作用。

Humanin拮抗Aβ_(31-35)诱导的神经元凋亡

为了研究Humanin(HN)对Aβ31-35诱导的大鼠皮层神经元凋亡的影响,本研究采用原代培养的大鼠皮层神经元,应用流式细胞术、TUNEL法、HO33342染色法检测不同时间(0、8、16h)加入不同浓度的HN对Aβ31-35致神经元凋亡的影响。结果显示:Aβ31-35(25μmol/L)引起培养皮层神经元的凋亡率明显增高,神经元凋亡率由7.43%上升到32.69%;凋亡指数由6.87%上升到28.36%(P<0.05)。与Aβ31-35同时或提前8h给予不同浓度(5,10,20μmol/L)的HN对Aβ31-35(25μmol/L)诱导的神经元凋亡均未产生影响;但20μmol/L的HN提前16h孵育可明显抑制Aβ31-35所致的神经元凋亡,其凋亡率由32.69%下降到20.36%,凋亡指数由28.36%下降到17.57%。本研究结果提示,HN拮抗Aβ31-35致神经元凋亡作用具有剂量和时间依赖性。

第Ⅲ组代谢型谷氨酸受体拮抗Aβ 31-35诱导神经元凋亡的机制探讨

目的:探讨第Ⅲ组代谢型谷氨酸受体(mGluRs)拮抗Aβ31-35诱导神经元凋亡的机制.方法:原代培养的大鼠额叶皮层神经元,加入第Ⅲ组mGluRs激动剂L-SOP或(R,S)-PPG,利用流式细胞仪和caspase酶系活性检测观察对Aβ31-35诱导神经元凋亡的影响.结果:第Ⅲ组mGluRs激动剂L-SOP或(R,S)-PPG明显抑制Aβ31-35引起的凋亡,其caspase-3活性降低,同时参与内源性凋亡的caspase-9和外源性凋亡的caspase-8活性均明显降低.结论:第Ⅲ组mGluRs激动剂通过内、外两条途径抑制Aβ31-35诱导的神经元凋亡.

Humanin通过JNK途径减轻Aβ_(31-35)诱导的皮层神经元的凋亡

目的研究JNK信号通路在Aβ31-35诱导神经元凋亡中的作用以及Humanin(HN)的神经保护机制。方法原代培养大鼠皮层神经元随机分为对照组、Aβ31-35组(1h,4h,8h,16h,24h)、抑制剂SP600125组、HN预处理组。应用流式细胞术观察各组神经元凋亡率,应用免疫细胞化学法观察各组磷酸化c-Jun(p-c-Jun)和FasL蛋白表达情况。结果对照组仅有少数神经元发生凋亡;Aβ31-35诱导培养皮层神经元异常凋亡;JNK抑制剂SP600125抑制了Aβ31-35诱导的神经元凋亡;HN(20μmol/L)16h预孵育部分抑制了Aβ31-35的致凋亡作用,各组神经元凋亡率分别为7.43%,32.6%(24h),8.8%,20.36%。对照组仅有少量p-c-Jun及FasL蛋白的表达;Aβ31-35时间依赖性诱导了p-c-Jun、FasL蛋白的表达;SP600125抑制了Aβ31-35诱导的p-c-Jun、FasL蛋白的表达;20μmol/LHN16h预孵育部分抑制了p-c-Jun及FasL蛋白的表达。结论JNK通路可能参与了Aβ31-35诱导的神经元凋亡过程;HN可在一定程度上阻抑JNK信号通路,减轻Aβ31-35诱导的神经元凋亡。

第Ⅲ组代谢性谷氨酸受体抑制Aβ_(31～35)诱导的神经元胞内钙增高

目的观察第Ⅲ组代谢型谷氨酸受体激动剂L-SOP和(R,S)-PPG对Aβ31～35所致培养神经元胞内Ca2+浓度升高的影响。方法原代培养的大鼠额叶皮层神经元,分别加入第Ⅲ组mG luR s激动剂L-SOP或(R,S)-PPG,利用实时Ca2+荧光成像技术观察对Aβ31～35所致〔Ca2+〕i升高的影响。结果急性给予Aβ31～35可引起培养神经元的〔Ca2+〕i水平呈剂量依赖性的升高,即随着Aβ31～35浓度的增加,其〔Ca2+〕i升高的幅度逐渐增加,而潜伏期逐渐缩短;经L-SOP或(R,S)-PPG预处理后,使Aβ31～35所引起的〔Ca2+〕i的平均升高幅度降低,平均潜伏期明显延长。结论在离体培养的神经元第Ⅲ组mG luR s的激活可通过抑制Aβ31～35引起的Ca2+超载,对Aβ31-35诱导的神经毒发挥保护作用。

艾塞那肽-4改善β淀粉样蛋白诱导的小鼠昼夜节律紊乱及时钟蛋白CLOCK蛋白的异常表达

目的探讨艾塞那肽(exendin)-4对β淀粉样蛋白(Aβ)引起的C57BL/6小鼠昼夜节律紊乱的影响,观察exendin-4对Aβ引起的海马时钟蛋白CLOCK蛋白异常表达的影响。方法海马内注射15 nmol Aβ31-35、50 pmol Exendin-4,对照组海马内注射等体积的高压三蒸水,利用Vital View跑轮分析软件观察各实验组小鼠昼夜节律的变化。蛋白质印迹法检测各组小鼠海马区CLOCK蛋白在不同时间的表达变化。结果 Aβ处理组小鼠出现明显昼夜节律紊乱,其自由运转周期为(23.67±0.05)h,鲁棒值为(22.5±4.3)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),Exendin-4预处理组小鼠昼夜节律部分恢复正常,其自由运转周期为(23.53±0.05)h,鲁棒值为(47.0±4.0)%,与Aβ处理组比较差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白质印迹法结果显示,对照组CLOCK蛋白在CT8和CT20表达高,在CT2和CT14时表达低,Aβ处理组CLOCK蛋白表达缺乏节律性,Exendin-4预处理组CLOCK蛋白部分恢复节律表达。结论 Exendin-4可部分恢复Aβ31-35导致的C57BL/6小鼠的昼夜节律紊乱,并部分纠正Aβ31-35引起的海马区CLOCK蛋白的异常表达。

[Gly14]-humanin拮抗Aβ_(31-35)引起的大鼠空间学习记忆损伤

淀粉样β蛋白(Amyloid β protein,Aβ)与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)发病机理密切相关,拮抗Aβ神经毒性或清除脑内沉积的Aβ已成为一个主要的AD治疗策略。本研究采用Morris水迷宫技术,探讨了海马内注射Aβ31-35对大鼠空间学习记忆行为的影响,并在此基础上研究了[Gly14]-humanin(HNG)拮抗Aβ的神经保护作用及其可能机制。结果显示,双侧海马注射2.0nmol的Aβ31-35后,大鼠定位航行试验中寻找水下平台的平均逃避距离较对照组明显延长;撤除平台后空间探索试验中目标象限内的游泳距离占游泳总距离的百分比明显下降;HNG(0.2和2.0nmol)预处理拮抗了Aβ31-35所致的逃避距离延长和游泳距离百分比下降;给予酪氨酸激酶抑制剂Genistein(40nmol)则几乎完全阻断HNG的抗Aβ效应。以上结果表明,HNG可以剂量依赖性保护大鼠的空间学习记忆免受Aβ伤害,其机制可能与激活内源性酪氨酸激酶途径有关,提示HNG上调酪氨酸激酶信号转导对AD患者认知功能的改善具有重要意义。

Humanin通过内源性途径抑制Aβ_(31-35)诱导的神经元凋亡(英文)

为了探讨Humanin(HN)对Aβ31-35诱导的培养皮层神经元凋亡的影响,本研究采用不同浓度(5、10、20μmol/L)的HN预孵育体外培养的皮层神经元不同时间(0、8、16h),加入Aβ31-35(25μmol/L)24h后,应用电子显微镜观察神经元的凋亡情况;流式细胞术、TUNEL法检测神经元的凋亡率;酶标仪检测caspase活性;Westernblot检测Bax蛋白的表达。结果显示:HN(20μmol/L)预孵育16h明显抑制了Aβ31-35诱导的神经元凋亡;HN降低了Aβ31-35诱导的caspase-3、9活性的升高;HN抑制了Aβ31-35诱导的Bax从胞浆到线粒体的转位。以上结果提示,HN通过阻断内源性凋亡途径抑制Aβ31-35诱导的神经元凋亡。

JNK激活的外源性凋亡途径介导Aβ_(31-35)诱导的神经元凋亡(英文)

目的探讨JNK信号通路在Aβ31-35诱导的神经元凋亡过程中的作用。方法经老化处理的Aβ31-35(终浓度为25μmol/L)制备AD细胞模型,采用生物比色法检测caspase-3和caspase-8的活性。采用免疫细胞化学技术观察不同时间点磷酸化c-Jun(p-c-Jun)及Fas ligand(FasL)蛋白的表达情况,并用IPP11.0图像分析软件进行定量分析。结果Aβ31-35孵育24h能显著提高神经元内caspase-3和caspase-8的活性。Aβ31-35孵育4h时p-c-Jun蛋白表达水平开始升高,在8h升高最显著,呈现一定的时间依赖性;JNK特异性抑制剂SP600125能抑制Aβ31-35对p-c-Jun蛋白表达的诱导作用。Aβ31-35孵育8h时出现FasL蛋白表达的升高,而SP600125则能抑制这一作用。结论JNK激活的外源性凋亡途径在Aβ31-35诱导的神经元凋亡过程中发挥一定的作用。

Humanin拮抗Aβ_(31-35)引起的培养皮层神经元胞内Ca^(2+)浓度升高

β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)在脑组织中的过多沉积与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发病密切相关。Aβ的毒性作用机制目前尚不明确,有研究认为扰乱细胞内钙稳态是其重要机制之一。Aβ31-35是一个小的Aβ活性片段,具有与完整肽链相同的神经毒作用。Humanin(HN)是一种存在于AD患者脑组织中具有神经保护作用的多肽,它能有效抑制Aβ诱发的神经元死亡。本研究应用Ca2+荧光成像技术,检测不同时间给予不同浓度的HN对Aβ31-35引起的培养皮层神经元[Ca2+]i升高的影响,探讨HN对Aβ31-35神经毒的抑制作用是否通过抑制Aβ31-35所致的细胞内钙稳态紊乱而实现。结果显示:HN(10μmol/L)预孵育10min部分抑制Aβ31-35(25μmol/L)所致的神经元[Ca2+]i的升高。当HN与Aβ31-35(25μmol/L)同时加入时,10μmol/L HN未能改变Aβ31-35(25μmol/L)引起的神经元[Ca2+]i升高的幅度,但可延迟[Ca2+]i的升高;而20μmol/L HN明显抑制了Aβ31-35(25μmol/L)引起的神经元[Ca2+]i的升高。以上实验结果提示,Aβ31-35引起神经细胞内钙稳态的紊乱是其神经毒作用机制之一;HN抑制Aβ31-35引起的神经元[Ca2+]i升高具有时间和剂量依赖性。