米曲霉RIB40高效同源重组和尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建

目的:以米曲霉RIB40为出发菌株,构建具有高同源重组效率的营养缺陷型菌株。方法:首先通过同源重组技术和5-氟乳清酸(5-Fluoroorotic Acid,5-FOA)对尿苷/尿嘧啶营养缺陷的筛选作用,获得AopyrG基因缺失的米曲霉RIB40。然后利用烟曲霉AfpyrG基因替换Aoku70得到ΔAoku70敲除菌株,再通过5-FOA的筛选作用使得ΔAoku70菌株基因组发生自身环化,丢失AfpyrG基因。最后为了检验ΔAoku70ΔAopyrG菌株的可用性,将编码红色荧光蛋白的mCherry基因敲入至双突变菌株的组蛋白H2B基因上,并通过激光共聚焦显微镜观察红色荧光蛋白质的亚细胞定位。结果:通过AopyrG和Aoku70的双基因敲除,获得了高同源重组效率的营养缺陷型菌株ΔAoku70ΔAopyrG。用激光共聚焦观察到红色荧光蛋白定位于细胞核,表明ΔAoku70ΔAopyrG菌株可用于米曲霉的基因改造。结论:ΔAoku70ΔAopyrG菌株可作为一个高同源重组效率的营养缺陷型出发菌株用于今后米曲霉RIB40的遗传改良。

低盐固态工艺条件下米曲霉3.042和米曲霉RIB40酿造酱油发酵性能的比较

探讨了在低盐固态酱油酿造工艺下,我国广泛应用的米曲霉3.042和日本的米曲霉RIB40在发酵性能方面的差异。对比了两株米曲霉种曲孢子数、大曲制备工艺、发酵过程中理化指标、有机酸含量以及酱油风味物质方面的不同。研究发现米曲霉3.042具有产孢快、生长迅速的特点。通过跟踪测定蛋白酶活、纤维素酶活和糖化酶活,确定了两株米曲霉的最佳收曲时间均为36h。同时发现米曲霉RIB40的糖化酶活很高(3208.939U/g干基,36h)。理化指标的变化情况表明:采用两株米曲霉制曲酿造酱油均达到了特级酱油标准。在有机酸方面,米曲霉RIB40酱醅的乳酸和乙酸的含量具有一定优势,这有利于酱油良好口感的形成。风味物质的检测结果表明:米曲霉RIB40酿造酱油中醇类物质具有优势,而米曲霉3.042在酯类物质方面具有优势。在实际生产中,可以根据产品需要选择合适的菌株。

稻瘟病菌热激蛋白(HSP)40编码基因MoMHF6的鉴定及功能研究

【目的】探明稻瘟病菌热激蛋白(HSP)40在形态分化和致病过程中的作用。【方法】利用DNA同源重组方法敲除了稻瘟病菌HSP40编码基因MoMHF6,获得ΔMomhf6突变体,并通过表型分析、基因回补、RNA-seq分析等对MoMHF6的生物学功能进行较系统的研究。【结果】敲除MoMHF6基因导致稻瘟病菌气生菌丝生长、无性产孢、孢子萌发、子囊壳产生和附着胞形成均显著下降,但与野生菌株相比,ΔMomhf6突变体在CM培养基上的径向生长没有显著差异,在子囊壳中仍可形成子囊和子囊孢子。在1、2和3 mol/L甘油溶液处理条件下,ΔMomhf6突变体附着胞塌陷率显著升高,说明MoMHF6与附着胞膨压形成有关。ΔMomhf6突变体对洋葱内表皮的穿透能力和对感病寄主的致病性完全丧失,甚至在划伤大麦叶片表皮组织中的扩展也受明显限制。而且,ΔMomhf6突变体对氧化胁迫的敏感性增强,附着胞发育过程中糖原的转运和降解缓慢,说明MoMHF6参与氧化胁迫反应和附着胞的糖原代谢。将完整的MoMHF6基因重新导入ΔMomhf6突变体可回补突变体的所有表型缺陷。另外,RNA-seq分析显示,部分已知的稻瘟病菌致病相关基因表达可能受MoMHF6调控,如MoATG4、MoPL1、MoVPR和GAS1等。【结论】综上所述,稻瘟病菌HSP40编码基因MoMHF6在产孢、附着胞形成、穿透寄主、氧化胁迫应答、致病等过程中起重要作用,研究结果对进一步阐明MoMHF6调控稻瘟病菌形态分化和致病过程的基因网络和分子机制具有重要意义。

米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40全长cDNA文库的构建

【目的】构建米曲霉RIB40的全长cDNA表达文库,为米曲霉功能基因的开发以及次生代谢产物合成途径相关基因的筛选与克隆奠定基础。【方法】采用RNAiso法从米曲霉RIB40菌体中提取总RNA。选用PolyATract mRNA Isolation System Ⅲ试剂盒分离纯化mRNA。以5μg mRNA为模板,按照ZAP-cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书要求合成单、双链cDNA,使用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后连接于Uni-ZAP XR表达载体上,体外包装后转染Escherichia coli XL1-Blue宿主菌。【结果】构建了米曲霉RIB40的全长cDNA文库,初级文库滴度约为2.96×106 CFU/mL,重组率约为97.8%,插入片段平均长度大于1.5 kb,达到一个高质量cDNA文库的要求。文库扩增后,滴度达到3.4×1010 CFU/mL。【结论】米曲霉RIB40全长cDNA表达文库的成功构建,将会对米曲霉基础生物学研究及相关基因的筛选与克隆奠定基础。

40%噻虫嗪·溴氰虫酰胺悬浮种衣剂对稻蓟马的防治效果

[目的]筛选防治稻蓟马的有效药剂.[方法]开展了40％噻虫嗪·溴氰虫酰胺FS防治稻蓟马的田间药效试验.[结果]药后15d,40％噻虫嗪·溴氰虫酰胺FS各剂量处理对稻蓟马的防效为98.42％～ 99.20％,药后30 d,40％噻虫嗪·溴氰虫酰胺FS各剂量处理对稻蓟马的防效为93.79％ ～ 99.29,药后40d的杀虫防效为32.83％ ～ 92.89％.[结论]40％噻虫嗪·溴氰虫酰胺FS的适宜用量为96g/100kg.