根癌农杆菌介导的fad2 RNA干扰体基因转化甘蓝型油菜的研究

Δ12-油酸去饱和酶(Delta-12 oleate desaturase FAD2)是植物产生多聚不饱和脂肪酸的关键酶。对fad2基因表达进行抑制,可提高油菜种子油酸的相对含量。依据hpRNA介导的RNAi技术的原理,构建了以甘蓝型油菜fad2基因为靶标的RNAi植物表达载体pCAMBIA3301-fad2i。以甘蓝型油菜Y14-1的带柄子叶作为转化受体,利用根癌农杆菌介导法,将fad2RNA干扰体基因导入甘蓝型油菜中,获得了PPT抗性植株。同时还探讨了影响Y14-1品种转化频率的几个要素,为甘蓝型油菜的高效转化提供参考依据。对获得的再生植株进行GUS组织化学染色检测和PCR检测,证明外源基因已整合到油菜基因组中。

养殖刺参腐皮综合征两种致病菌Dot-ELISA快速检测

以养殖刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征两种主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为抗原,分别制备兔抗血清,建立了两种病原菌的点酶ELISA(Dot-ELISA)检测方法。根据方正试验,确定检测用一抗、二抗最佳工作稀释度:灿烂弧菌抗血清稀释度320,酶标二抗稀释度3 000;假交替单胞菌抗血清稀释度160,酶标二抗稀释度2 000。阻断试验结果表明两种抗血清特异性均较高。灿烂弧菌抗血清在稀释度为40时与溶藻胶弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等弧菌发生微弱交叉反应,提高稀释度到160时,不发生交叉反应。假交替单胞菌抗血清基本不与常见海水致病弧菌发生交叉反应。人工感染试验检测结果表明该方法能从患病海参溃烂组织、未发病海参组织和感染水体检测到相应致病菌,检测灵敏度为9.4×103个/mL。人工感染试验检测结果经直接凝集反应验证。该方法操作简便、灵敏度高,不需复杂仪器设备,适合在基层推广。

蝴蝶兰ACC氧化酶和ACC合成酶融合反义表达载体的构建

为了获得具有超常花期的蝴蝶兰新品系,根据已报道的蝴蝶兰ACC合成酶(ACS)基因和ACC氧化酶(ACO)基因的序列,设计引物从蝴蝶兰总RNA中克隆出ACS保守区的461 bp片段和ACO的333 bp片段,完成2个基因的克隆和测序后,将ACS基因片段和ACO基因片段以反义的方向插入到中间载体pBI221 CaMV启动子的下游,酶切后获得含有CaMV启动子的ACS和ACO基因的反义融合片段。将此包含启动子的反义融合片段连接到植物表达载体pCAM-BIA3301中,获得ACC合成酶基因和ACC氧化酶基因融合的反义表达载体,将构建好的植物表达载体转化农杆菌LBA4404,用于侵染蝴蝶兰原球茎。

棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库的构建及致病缺陷突变体筛选

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染引起的棉花黄萎病是棉花生产上的重要病害之一,而其致病的分子机制尚不清楚,为此,以强致病力落叶型黄萎病菌FGH2为材料,利用农杆菌介导转化技术构建棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库并进行致病缺陷突变体的筛选。当农杆菌与黄萎病菌分生孢子浓度比为250∶1、承载介质为NC膜、乙酰丁香酮浓度400μmol/L、共培养时间48h时,转化效率高达每106个分生孢子产生612.5个转化子。通过采用优化后的转化体系,构建了含1 200个T-DNA插入转化子的棉花黄萎病菌突变体库。利用苗期分生孢子蘸根法测定300个转化子在棉花幼苗上的致病力,获得3个致病力显著降低的突变体181、546、1009,其中546的微菌核形成能力丧失,1009的微菌核形成能力明显下降。黄萎病菌T-DNA插入突变体库的构建,为棉花黄萎病菌致病及微菌核形成机制的研究奠定了基础。

解淀粉芽胞杆菌的安全性分析

评价对鲟源嗜水气单胞菌具有优良拮抗效果的解淀粉芽胞杆菌G1的安全性,以期推动其在水产养殖中的应用进程。通过特异PCR法检测了菌株G1的毒力基因,并采用纸片法分析了其对水产药物的耐药性,观察了其对小鼠和草鱼的毒力。结果表明,菌株G1不含有溶血素基因、肠毒素T基因、肠毒素FM基因;对诺氟沙星、恩诺沙星、新霉素、复方新诺明、甲氧嘧啶、链霉素、氧氟沙星、庆大霉素、复合磺胺等9种水产常用药物以及呋喃唑酮、环丙沙星、氯霉素、红霉素等4种水产禁用药物高度敏感;对四环素中度敏感。此外,菌株G1在105 cfu/g～109 cfu/g注射剂量下对小鼠和草鱼无致病性,对小鼠和草鱼的LD50大于109 cfu/g,为无毒菌株。

农杆菌不同菌液浓度对柳枝稷种子萌发及幼苗生长发育的影响

以柳枝稷品系‘西稷1号’、‘西稷2号’和‘西稷3号’为主区,以农杆菌菌液浓度为副区,对农杆菌浸种处理后柳枝稷种子萌发及幼苗生长发育相关性状进行了研究。结果表明,品系与农杆菌菌液浓度的互作效应不显著;不同基因型品系对农杆菌的敏感程度不同,其中西稷3号最不敏感;随着农杆菌菌液浓度的升高,柳枝稷种子发芽率、幼苗成苗率及叶绿素含量呈下降趋势,幼苗POD活性、CAT活性、MDA含量呈上升趋势,SOD活性呈先升后降的趋势。综合农杆菌对柳枝稷种子萌发及幼苗生理生化特性影响,在柳枝稷农杆菌浸种转化法中菌液浓度控制在1.2OD600较为适宜。

处理时间对农杆菌介导甘蓝转化中抗性芽分化率的影响

以甘蓝下胚轴为材料,研究根癌农杆菌转化过程中预培养、感染、共培养各阶段中处理时间对出愈率和抗性芽分化率的影响。结果表明,不同阶段处理时间对甘蓝的出愈率和转化效率有明显的影响,甘蓝转化过程中预培养、感染、共培养的最佳处理时间分别为36h、5min、48h。

具有降解亚硝酸盐活性的解淀粉芽孢杆菌的分离与安全性分析

从养殖污泥中分离筛选了一株优良的亚硝酸盐降解菌YX01,经ARIS 2X细菌自动鉴定系统以及16SrRNA系统发育分析,该菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens,GenBank登录号为JX649949),其16SrRNA序列与基因库中芽孢杆菌属菌株的16SrRNA序列有99%～100%的同源性,而且与解淀粉芽孢杆菌菌株LD5(GenBank登录号:GQ853414)的亲缘关系最近。该亚硝酸盐降解菌YX01在浓度为2.0×107～2.0×109 cfu/L时对小球藻(Chlorellasp.)生长有促进作用;在浓度大于2.0×1011 cfu/L时对小球藻生长具有显著抑制作用;亚硝酸盐降解菌YX01对小球藻的半数抑制浓度(IC50)大于2.0×1011cfu/L。亚硝酸盐降解菌YX01对大型蚤(Daphnia magna)的48h-半数致死浓度(LC50)大于2.0×1011cfu/L,对草鱼(Ctenopha-ryngodon idellus)的96h-LC50大于2.0×1011 cfu/kg。经分析,亚硝酸盐降解菌YX01为无毒菌株。

1株烟草赤星病拮抗芽孢杆菌的鉴定与活性研究

【目的】筛选对烟草赤星病具有拮抗作用的芽孢杆菌并进行鉴定,同时研究其抗菌作用。【方法】从陕西、云南、湖北和河南4省烟区采集烟草根际土壤和烟叶,从中分离筛选烟草赤星病拮抗芽孢杆菌,并对拮抗性最强的1株芽孢杆菌进行形态学、生理生化特性、16SrDNA序列鉴定及粗提物抑菌作用测定。【结果】从烟草表面及根际土壤分离得到的芽孢杆菌中有10株对烟草赤星病有拮抗效果,将其中效果最好的1株芽孢杆菌定名为M-07C2F,其抑菌条带宽度达14.2mm;通过16SrDNA测序并结合其形态和生理生化特征,鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。通过显微观察发现,M-07C2F菌株使烟草赤星病病原真菌的菌丝生长出现畸形,菌丝体内部细胞原生质体分布不均匀,部分菌丝内原生质有流出形成空壳的现象。在离体条件下采用生长速率法,测得其对烟草赤星病菌丝生长有抑制作用,EC50为12.82mg/L;在活体条件下采用田间小区试验,测得当M-07C2F菌株粗提物质量浓度为80mg/L时,其对烟草赤星病的防治效果达到86.0%。【结论】菌株M-07C2F对烟草赤星病菌的抑菌作用明显,该菌株通过抑制烟草赤星病菌菌丝生长、减少孢子萌发来抑制病菌对植株的侵染,且菌株粗提物质量浓度越高,抑菌能力越强。

常见水产药物对两种水产益生菌活性的影响

为探求水产药物影响反硝化细菌和芽孢杆菌组成的微生态制剂的水质净化效果,研究了高锰酸钾、硫酸铜合剂、二氧化氯、戊二醛和阿维菌素对反硝化细菌和芽孢杆菌生长和脱氮的影响。试验结果表明,反硝化细菌对高锰酸钾、戊二醛和二氧化氯较为敏感,高锰酸钾质量浓度为4mg/L,戊二醛质量浓度为0.1mg/L时,反硝化细菌对亚硝酸盐氮的去除率显著降低(P<0.05),二氧化氯质量浓度为0.3mg/L时,反硝化细菌的生物量和脱氮能力显著降低(P<0.05),在实际应用中应避免混合使用;而反硝化细菌对硫酸铜合剂、阿维菌素不敏感,可以混合使用;芽孢杆菌对高锰酸钾,硫酸铜合剂,二氧化氯较为敏感,高锰酸钾质量浓度为2mg/L,硫酸铜合剂质量浓度为0.25mg/L,二氧化氯质量浓度为1mg/L时,芽孢杆菌的对亚硝酸盐氮的去除率显著降低(P<0.05),应避免混合使用,而芽孢杆菌对戊二醛、阿维菌素不敏感,可以混合使用。

解淀粉芽孢杆菌高密度发酵条件的优化

该文探讨解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)1841的高密度工业发酵工艺优化,为解淀粉芽孢杆菌的工业化生产提供依据。以平板菌落直径、及培养后的活菌浓度为指标,对种子的保存方法、活化方式和培养基、发酵培养基中的酵母粉和大豆蛋白粉用量以及发酵的后期调控进行筛选和优化。筛选出最佳的工业菌种保存条件为30%甘油为保护剂,-64℃保存;最佳活化方法为采用PDA培养基活化,并经过一次48 h活化和24 h二次活化;最佳的转菌时间为在种子培养后17~18 h。最佳的酵母粉和大豆蛋白粉浓度分别为20 g/L和40 g/L,发酵的后期调控需要进行补料和流加氨水将p H控制在7.0±0.2,发酵时间延长至72 h。通过对发酵的基本条件进行筛选和优化,得到可在100 L发酵罐上进行高密度发酵的体系,发酵浓度可达常规发酵的100倍(>1×1014CFU/m L)。

匍匐翦股颖农杆菌转化体系的研究

以匍匐翦股颖品种回旋、潘娜A-1、L-93的胚性愈伤组织为受体材料,利用根癌农杆菌EHA105介导将外源NAS基因导入其中,通过G418(40mg/L)筛选40d,分化培养得到再生植株,通过分子检测检出阳性株,最终农杆菌的转化率分别为0.90%、1.54%、2.02%。

农杆菌介导的多裂叶荆芥转化体系建立

为了建立根癌农杆菌介导的多裂叶荆芥转化体系,以携带pBI121-gfp质粒的根癌农杆菌LBA4404菌株介导,荆芥试管苗带叶腋茎段为转化受体材料,探究了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间4个因素对荆芥转化效果的影响。每个因素设置4个水平,以L16(45)正交实验进行,筛选的卡那霉素抗性芽进行GFP荧光检测和PCR检测。结果表明,gfp基因成功导入转化植株,预培养5d、菌液浓度OD600为0.7、侵染15min、共培养3d为多裂叶荆芥的最优转化条件。转化率为20%,每个外植体再生抗性不定芽数平均为5个。荆芥转化体系的建立为利用植物基因工程改良其遗传性状奠定基础。

解淀粉芽孢杆菌抑菌活性初步研究

为了进一步分离纯化抑菌蛋白和脂肽类物质，促进拮抗菌的开发和利用，选取2株对多种植物病原真菌具有良好拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌，利用硫酸铵沉淀法粗提2株菌株的抑菌蛋白，酸沉淀法粗提脂态类抑菌物质，分别测定粗提物对多种植物病原真菌的抑制效果。初步检测2株菌株是否具有产纤维素酶、蛋白酶和嗜铁素活性。结果表明：BQD1菌株20％～30％的蛋白粗提液对玉米大斑病菌拮抗作用最强，抑菌直径达31．48 mm。 TY 菌株30％～40％的蛋白粗提液对玉米大斑病菌抑菌直径最高达34．20 mm。2株菌株脂态类粗提液对靶标病原菌株的拮抗作用均高于其发酵液，且均可产生纤维素酶、蛋白酶和嗜铁素。

解淀粉芽孢杆菌与九种农药的相容性及对苹果斑点落叶病田间防效的评价

以解淀粉芽孢杆菌HMQAU140045为研究对象,将其与苹果园常用9种杀菌剂进行了相容性试验,并分析了田间防治苹果斑点落叶病的效果。结果表明:在最高田间推荐剂量下多菌灵、醚菌酯、腐霉利均可促进解淀粉芽孢杆菌的生长;异菌脲、甲基硫菌灵、代森锰锌、多抗霉素轻微抑制其生长;苯醚甲环唑和戊唑醇强烈抑制其生长。田间药效试验结果表明,1×107 cfu·mL^(-1)解淀粉芽孢杆菌HMQAU140045菌悬液与70%代森锰锌WP500倍液、60%醚菌酯WDG 4 000倍液、80%多菌灵WP 800倍液、50%异菌脲WP 1 250倍液交替施用可有效控制苹果斑点落叶病的危害,秋梢停止抽生后防效达71.78%以上,对苹果树安全,提供了一条防治苹果斑点落叶病减量控害的有效手段。

海洋低温过氧化氢酶菌株的筛选及酶学性的研究

从渤海湾海域海泥海水混合物中分离获得一株产低温过氧化氢酶菌株CZA1202,通过菌株的形态特征、生理生化和16SrDNA序列鉴定为Serratia liquefaciens。对其酶学性质进行初步研究,CZA1202所产过氧化氢酶最适反应温度30℃,最适pH 7.0,在pH 7.0～9.0范围内较稳定,在35℃保持60min条件下,酶活可保留70%。初始酶活达到107.8U/mL。

根癌农杆菌介导的向日葵遗传转化的研究

以向日葵无菌苗的子叶节为外植体,通过农杆菌介导法,对其遗传转化条件进行了研究,建立了向日葵子叶节农杆菌介导的遗传转化体系.结果表明:在农杆菌浸染前(浸染浓度为OD600=0.6)进行2 d的预培养、浸染8 min的外植体在MS+1.2 mg/L 6-BA+0.03 mg/L IAA的培养基上转化效率较高.PCR检测初步证明,LycB基因已整合到向日葵再生植株中.

辅酶Q_(10)产生菌的原生质体制备与再生条件研究

【目的】选用辅酶Q10产生菌深红红螺菌和根癌土壤杆菌为出发菌株,系统研究其原生质体制备和再生条件,为辅酶Q10的工业化生产提供技术支持。【方法】从菌龄、溶菌酶质量浓度、酶解时间、酶解温度、高渗溶液的选择等,对深红红螺菌和根癌土壤杆菌2株菌进行了原生质体制备和再生条件的研究。【结果】①根癌土壤杆菌原生质体制备和再生的适宜条件为:菌龄13.5 h,高渗溶液为0.8 mol/L NaCl,溶菌酶质量浓度为0.2 mg/mL,酶解时间75 min,酶解温度35℃;②深红红螺菌原生质体制备和再生的适宜条件为:菌龄45 h,高渗溶液为0.5 mol/L蔗糖+0.02 mol/L的MgCl2.6H2O,溶菌酶质量浓度为3 mg/L,酶解时间60 min,酶解温度37℃。【结论】得到了根癌土壤杆菌AT-N10和深红红螺菌Rh1.5005适宜的原生质体制备和再生条件。

解淀粉芽孢杆菌对非洲菊切花保鲜效应的研究

以从花卉中分离得到的解淀粉芽孢杆菌液为保鲜材料,研究其对非洲菊的生物保鲜效果.通过非洲菊形态指标的测定,选取最佳保鲜液的浓度为解淀粉芽孢杆菌发酵液2d的质量百分比0.6%;并对非洲菊的生理指标中花青素含量、可溶性蛋白含量、MDA、POD进行了测量.结果表明:此保鲜液能显著增加非洲菊花瓣花青素的含量与可溶性蛋白含量,同时有效抑制MDA含量增加与POD活性降低.此保鲜液提高了非洲菊的观赏价值,具有良好的生物保鲜作用.