候选hEra结合蛋白A19/GST的融合表达及其抗体的制备

目的:在大肠杆菌中表达候选人Era结合蛋白A19/GST融合蛋白,并制备兔抗A19抗体。方法:利用人Era蛋白全长作为诱饵,进行胎肝cDNA文库的酵母双杂交筛选。将得到的候选人Era结合蛋白A19的编码基因序列克隆入pACT2载体中,构建pACT2A19。用PCR扩增A19蛋白的编码基因序列,克隆入融合表达载体pGEX4T3中,构建A19的表达菌,并经IPTG诱导表达A19蛋白。用SDSPAGE分析及薄层扫描检测目的蛋白的含量。用A19蛋白免疫家兔制备抗血清,以Westernblot鉴定抗体的特异性并检测抗体的效价。结果:大肠杆菌中表达的A19蛋白占菌体总蛋白的30.2%。Westernblot分析显示,抗血清具有较高的特异性,其效价约为1∶4000。结论:成功地获得了候选的人Era结合蛋白A19,制备了兔抗A19抗血清,为后续Era功能的研究奠定了基础。

柯萨奇病毒A组19型VP1蛋白生物信息学分析

目的分析柯萨奇病毒A组19型(coxsackievirus A19,CVA-19)VP1蛋白的理化性质、结构功能并预测其线性B细胞表位和T细胞表位。方法应用ProtParam分析CVA-19 VP1蛋白的理化性质;ProtScale预测其亲疏水性;使用SignalP 6.0、DeepTMHMM、NetPhos-3.1和Motif Scan分别预测CVA-19 VP1蛋白的信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点和脂酰化位点;利用NetCGlyc-1.0、NetNGlyc-1.0和NetOGlyc-4.0分别预测CVA-19 VP1蛋白的C-甘露糖基化位点、N-糖基化位点和O-N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine,GalNAc)(粘蛋白型)糖基化位点;通过SOPMA和SWISS-MODEL在线工具分别预测CVA-19 VP1蛋白的二级结构和三级结构;使用网络服务器IEDB、Bepipred 3.0、ABCpred和SVTMrip联合预测其线性B细胞表位;应用IEDB和SYFPEITHI综合预测其T细胞表位。结果CVA-19 VP1蛋白的分子质量为33.099 ku,等电点为5.84,不稳定系数为37.50,总平均亲水性为-0.185,是一种稳定的亲水性蛋白,无信号肽、跨膜区和脂酰化位点。预测该蛋白含有30个可能的磷酸化位点、1个N-糖基化位点和7个O-GalNAc(粘蛋白型)糖基化位点,但无C-甘露糖基化位点。CVA-19 VP1蛋白的二级结构中,α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占24.66%、24.32%、2.70%和48.31%,以无规则卷曲为主。预测出该蛋白有6个潜在优势线性B细胞表位、3个潜在优势细胞毒性T淋巴细胞表位和9个潜在优势辅助性T细胞表位。结论用生物信息学方法预测CVA-19 VP1蛋白为稳定的亲水性蛋白,含有多个潜在的优势线性B细胞表位和T细胞表位,为进一步鉴定其线性表位奠定了基础,有助于CVA-19的抗体制备和疫苗研发。