亚甲蓝介导的光动力疗法诱导人表皮鳞状细胞癌A431细胞株凋亡机制研究

目的研究亚甲蓝介导的光动力疗法对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株的杀伤作用以及其诱导凋亡的机制,为亚甲蓝光动力临床应用提供理论依据以及最佳治疗参数。方法采用亚甲蓝与人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株共同孵育,经630 nm红光照射。采用CCK-8法检测细胞生长的抑制率,确定培育时间、亚甲蓝浓度对A431细胞株的抑制作用。采用免疫组化法检测A431细胞在亚甲蓝光动力作用前后细胞色素c(Cyt-c)在细胞内的分布情况。最后,采用Western-blot方法检测亚甲蓝光动力治疗后细胞凋亡过程中,线粒体凋亡途径相关蛋白Bcl-2和Bax的表达情况。结果CCK8法检测结果显示亚甲蓝光动力组对A431细胞具有杀伤作用,其杀伤作用与亚甲蓝的药物浓度以及亚甲蓝光动力作用后的孵育时间具有密切相关。Cyt-c免疫荧光结果显示亚甲蓝光光动力作用后,细胞凋亡率空白对照0%,光照对照组8%,亚甲蓝对照组12%,光照后1 h 22%,光照后2 h 26%,光照后4 h 31%,光照后6 h 54%。Western blot的检测结果显示亚甲蓝光动力作用激活A431细胞线粒体凋亡途径,启动Bcl-2家族参与凋亡过程。随着亚甲蓝光动力作用后孵育时间的延长,促凋亡蛋白Bax上调,抗凋亡蛋白Bcl-2下调。结论亚甲蓝光动力能明显抑制A431细胞的增殖,并诱导其发生凋亡。凋亡的发生与启动细胞色素c相关的线粒体凋亡途径相关。

白藜芦醇对人皮肤癌细胞株A431生长抑制机制实验研究

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对人皮肤癌细胞株A431和正常角质形成细胞株HaCaT体外生长的影响及其机制;并与顺铂(DDP)比较,评价Res作为天然抗肿瘤药物的潜在价值。方法培养A431细胞和HaCaT细胞,使用不同浓度Res或单独DDP处理后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测其对细胞的增生抑制率;相差显微镜下观察细胞的形态改变;流式细胞术分析细胞凋亡情况;免疫组织化学染色法检测Bcl-2和Caspase-3蛋白。结果①Res和DDP均能明显抑制A431细胞的增生,并呈时间——剂量依赖性;在各自相应半数抑制浓度(IC50),DDP对HaCaT细胞的增生抑制率高于Res(P<0.05);②镜下观察可见Res处理后A431细胞呈现凋亡的形态特征;流式细胞检测发现A431细胞的凋亡呈时间——剂量依赖性;免疫组织化学染色可见Bcl-2蛋白着色减弱、Caspase-3蛋白表达增强。结论Res对A431的增生具有一定的抑制作用,且不良反应较DDP弱;Res也可诱导A431发生凋亡,可能与抑制Bcl-2表达、促进caspase-3表达有关。

纳米雄黄抑制A431细胞株新生血管的机制研究

目的:探讨纳米雄黄抑制人皮肤鳞癌A431细胞新生血管的作用及其相关机理。方法:对皮肤鳞癌A431细胞进行体外培养,分别采用免疫组织化学法和RT-PCR法检测不同浓度纳米雄黄处理后其色素上皮源性因子(PEDF)和VEGF mRNA的表达情况。结果:对照组、5%、15%、25%纳米雄黄组、DDP组、综合组A4 3 1细胞PEDF表达阳性率分别为(21.50±2.28)%、(28.81±2.75)%、(42.23±2.35)%、(56.80±3.80)%、(46.33±2.07)%、(59.82±4.80)%;VEGF mRNA相对表达量为(86.30±6.44)%、(72.45±5.37)%、(52.74±7.21)%、(44.81±4.34)%、(30.92±4.12)%、(18.35±5.09)%。可见,经纳米雄黄作用后,人皮肤鳞癌A431细胞PEDF的生成量明显升高,VEGF转录mRNA水平显著降低,均呈剂量依赖性,与顺铂联合有协同作用。结论:体外实验表明纳米雄黄抑制A431新生血管生成的作用可能与上调PEDF的表达和下调VEGF的表达有关。

黄芩素抑制皮肤鳞癌细胞株A431增殖的体外研究

目的研究黄芩素(BAI)对鳞状细胞癌A431细胞的增殖、集落形成及细胞周期的影响,探索BAI抗肿瘤的作用机制。方法以体外培养的人表皮鳞癌A431细胞株为研究对象,MTT法观察BAI对A431细胞的生长抑制作用,光镜和电镜观察细胞形态,集落形成实验观察BAI对瘤细胞的生长抑制,流式细胞仪检测细胞周期中各期细胞比例和凋亡率。结果 MTT法显示,随着BAI作用时间延长及剂量增加对A431细胞增殖的抑制作用增强,有明显的时间和剂量依赖性,与对照组比较差异有显著性(P<0.01);光镜显示,随黄芩素浓度的增大细胞生长速度明显受到抑制,形态变圆;电镜显示,A431细胞伪足明显缩短,数量减少;流式细胞仪检测显示,随BAI浓度及作用时间的延长,细胞周期被明显阻断在S期,凋亡率增高,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。结论①BAI处理48h后,抑制A431细胞增殖而无细胞毒性的最适剂量范围为10～30μM;②BAI能明显地抑制皮肤鳞癌A431细胞增殖、细胞周期的进程、瘤细胞集落及伪足形成。

黄连水提物对人皮肤肿瘤A431细胞凋亡、增殖的影响

目的探讨黄连水提物对人皮肤肿瘤A431细胞凋亡、增殖的影响。方法采用低温提取工艺,从药材中提取出水溶性的小分子混合物,用紫外色谱分析仪检测混合物成分;采用MTT法检测药物对人皮肤肿瘤A431细胞的抑制作用,药物设4个浓度,即6.3、12.5、25、50μg/μL,并将其作为药物组,未加药物的为对照组,观察24、48、72 h抑瘤率;然后用Tunel检测细胞凋亡现象;通过MTT筛选后,用25μg/μL黄连水提物作用肿瘤A431细胞48 h后,用Western blot检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2凋亡途径的影响。结果紫外光谱分析黄连水提物主要成分为核酸、生物碱等,MTT显示25μg/μL黄连水提取物在48 h对A431细胞的抑制率已达到最佳(P <0.05)。显微镜下,对照组无变化。25μg/μL黄连水提物孵育48 h后,细胞明显的数量减少、变圆、漂浮;Tunel显示25μg/μL黄连水提物核定位处绿光明显增多,提示细胞大量凋亡。本研究检测显示,25μg/μL黄连水提取物孵育48 h后,肿瘤A-431细胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达量显著升高,而Bcl-2的表达量显著降低。结论本研究初步表明黄连水提小分子混合物可促进A-431细胞凋亡,抑制细胞增殖。其机制包括细胞外凋亡通路和细胞内凋亡通路,导致肿瘤细胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9上调及抑制凋亡蛋白Bcl-2的下调。这进一步明确了黄连水提物在治疗皮肤肿瘤中的作用机制,为皮肤肿瘤的治疗提供的方法。

NOD/SCID小鼠中A431侧群与非侧群细胞成瘤组织中EMT相关分子的表达

目的旨在分离A431中侧群(SP)细胞及非侧群(NSP)细胞亚群,比较二者在小鼠皮下成瘤能力差异及组织中上皮间质转化(EMT)相关分子表达。方法培养A431细胞经荧光染料Hoeehst33342染色后,流式细胞仪分选出SP细胞和NSP细胞,接种到NOD/SCID小鼠皮下,观察各自成瘤能力,取瘤体组织免疫组织化学染色检测EMT相关分子E-Cadherin、β-catenin、Vimentin、AXL和Erbb3的表达。结果 A431细胞系中成功分选出SP细胞,小鼠皮下成瘤迅速。在SP细胞小鼠成瘤组织周围细胞中,E-Cadherin、Erbb3表达降低,β-catenin、Vimentin、AXL表达增高。结论 A431细胞中含有SP细胞亚群,该亚群细胞具有较强的肿瘤形成能力,且显示较强的EMT特性。

双氢青蒿素对皮肤鳞状细胞癌A431细胞及人表皮角质形成细胞Hacat增殖凋亡影响的研究

目的探讨双氢青蒿素对皮肤鳞状细胞癌A431细胞及人表皮角质形成细胞Hacat的增殖及凋亡的影响。方法研究对象为人皮肤鳞状细胞A431细胞及人表皮角质形成细胞Hacat,实验分为空白对照组、双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)组(20、40、60、80μmol/L)。各组细胞药物干预24、48、72h后进行检测,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察各组细胞增殖能力;流式细胞(FCM)实验检测细胞凋亡。结果 DHA以时间和剂量依赖性的方式抑制A431和HaCaT细胞增殖。不同浓度的DHA刺激细胞后24、48、72h,与对照组相比,A431细胞生长抑制率明显降低,并在80μmol/L DHA刺激72h时达到峰值。HaCaT细胞中得到了相似的结果,但生长抑制率降低的没有A431细胞那么明显。A431细胞和HaCaT细胞预处理后用60μmol/L DHA刺激48h,与对照组比较,测定细胞中,A431细胞凋亡显著增加,差异有统计学意义(P<0.05),同时对HaCaT细胞无影响,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 DHA可抑制皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖及促进凋亡,而且对正常细胞影响较小。

穿心莲内酯对人皮肤基底细胞癌A431细胞生长、凋亡及增殖细胞核抗原蛋白表达的影响

目的探讨穿心莲内酯(AD)对人皮肤基底细胞癌A431细胞生长、凋亡及增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达的影响。方法应用酸性磷酸酶(APA)法检测细胞增殖抑制率,荧光显微镜观察细胞形态,Annexin V-FITC/PI双染法、流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,Rh123染色FCM检测细胞线粒体膜电位,免疫细胞化学法检测细胞PCNA蛋白表达。结果 AD呈时间、剂量依赖性抑制A431细胞生长增殖;且同一时间点50mg/L、100mg/LAD组与溶媒对照组相比差异显著(P<0.05)。AD组作用A431细胞24h时,部分细胞核染色质出现典型凋亡形态学改变。不同浓度AD作用A431细胞24h,早期凋亡率、晚期凋亡及坏死率均随AD浓度升高而逐渐增加,且50mg/L、100mg/L AD组与溶媒对照组相比差异显著(P<0.05)。AD作用A431 24h细胞内PCNA蛋白随AD浓度升高表达逐渐减少。AD作用A431细胞24h后,线粒体膜电位下降明显,与溶媒对照组相比较,50mg/L、100mg/LAD组差异有统计学意义(P<0.05)。结论 AD可明显抑制A431细胞生长增殖,其抑制细胞增殖可能与下调PCNA蛋白表达有关。AD能诱导A431细胞凋亡,其凋亡机制可能与细胞线粒体膜电位下降有关。

靶向VEGF的shRNA对皮肤鳞癌A431细胞的作用

目的在皮肤鳞癌细胞(A431)中下调VEGF mRNA和VEGF蛋白的表达,观察其对A431细胞增殖、迁移和黏附的影响。方法构建psVEGF-shRNA真核表达质粒(psilencer-VEGF1-shRNA,VEGF-s1;psilencer-VEGF2-shR-NA,VEGF-s2)干预A431细胞,同时构建含随机靶序列的阴性对照表达质粒(psilencer-Target-off-shRNA,T-off)。RT-QPCR,Western blot和ELISA检测细胞内VEGFmRNA和蛋白表达;CCK-8法检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期百分比与细胞凋亡;划痕试验和Transwell小室试验检测细胞二维、三维空间的迁移能力;FN黏附试验检测细胞黏附潜能。结果 A431细胞转染psVEGF-shRNA后活性降低,细胞周期发生阻滞,与对照组相比细胞比率显著增加,在G1期明显降低,在S期伴细胞调亡增加。细胞内VEGFmRNA和VEGF蛋白表达下降,细胞迁移和黏附潜能力均受到抑制(P<0.05)。结论 VEGF是人皮肤鳞癌A431细胞生长相关的重要基因,干扰VEGF基因能有效抑制A431细胞的增殖、迁移和黏附。

色素上皮衍生因子在A431细胞的表达及对其增殖的影响

目的明确色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)在A431细胞的表达情况以及对其增殖影响。方法采用RT-PCR和Western-blot分别检测A431细胞PEDF mRNA和蛋白的表达;MTT方法检测PEDF对A431细胞增殖的影响。结果A431细胞在mRNA和蛋白水平均可检测到PEDF的表达。此外,100ng/ml的PEDF可以抑制A431细胞的增殖。结论PEDF抑制A431细胞增殖,有望用于皮肤鳞癌的治疗。

不同剂量ALA-PDT对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖的抑制作用

目的:确定5-氨基酮戊酸-光动力疗法对皮肤鳞状细胞癌A431细胞抑制的最佳剂量。方法:体外培养人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株,应用MTT法检测不同ALA浓度(0.5、1、2 mmol/L)、不同PDT光照剂量(5、10、20、40 J/cm^2)下A431细胞的增殖水平。结果:当ALA浓度为0.5 mmol/L时,光照剂量为5、10、20、40 J/cm^2对A431细胞的抑制率分别为6%、10%、15%、18%;当ALA浓度为1mmol/L时,光照剂量为5、10、20、40 J/cm^2对A431细胞的抑制率分别为30%、52%、80%、82%;当ALA浓度为2 mmol/L时,光照剂量为5、10、20、40 J/cm^2对A431细胞的抑制率分别为31%、54%、81%、82%。结论:ALA在浓度为1 mmol/L,光照剂量为20 J/cm^2时,ALA-PDT对A431细胞增殖抑制效果达到最佳。

Id-1 mRNA在人皮肤鳞状细胞癌A431细胞中的表达

目的:检测Id-1 mRNA在体外培养的人皮肤鳞状细胞癌A431细胞中的表达。方法:采用RT-PCR法检测Id-1 mRNA在人皮肤鳞状细胞癌A431细胞和角质形成细胞中的表达。结果:Id-1 mRNA在A431细胞中高表达,而在人角质形成细胞中低表达或不表达。结论:Id-1 mRNA的高表达可能与皮肤鳞状细胞癌的发生有关。

新型维A酸CD437对表皮样癌A431细胞的致凋亡作用

目的研究一种新合成的维A酸CD437及全反式维A酸(ATRA)对体外培养的人表皮样癌细胞系(A431)及正常人类表皮角质形成细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用。方法MTT法测定CD437及ATRA对A431细胞系及正常人类表皮角质形成细胞的增殖抑制作用,光镜观察两种药物对细胞形态的影响,用流式细胞术研究两种药物对细胞凋亡及细胞周期的影响。结果维A酸CD437较传统ATRA更显著抑制A431细胞系的生长,并具有时间、浓度依赖性;显微镜观察可见细胞有细胞毒性、凋亡特征性改变;CD437可促进A431细胞的快速凋亡及正常人类表皮角质形成细胞G1期抑制;与CD437相比,ATRA对A431细胞的促凋亡作用相对无效;CD437不能诱导正常人类表皮角质形成细胞发生显著凋亡。结论与传统维A酸ATRA相比较,CD437更有效抑制表皮样癌细胞的增殖并显著诱导其凋亡;相对于正常表皮角质形成细胞,CD437对A431细胞具有选择性诱导凋亡作用,从而为临床治疗或预防皮肤癌提供实验依据。

A431鳞状细胞异种移植瘤模型中c-Kit信号通路诱导其对EGFRIs耐药机制的影响

目的建立EGFRIs(吉非替尼)耐药的EGFR野生型移植瘤模型,并研究其可能耐药机制。方法雌性BALB/c裸鼠皮下注射A431细胞,肿瘤生长到150×200mm^3,口服给予50mg/kg的吉非替尼,1次/d,连续25周后对EGFRIs产生耐药。比较敏感和耐药移植瘤的全基因组基因表达谱寻找目的基因。耐药模型分别接受空白对照组、吉非替尼、目的基因抑制剂(AMG706),或它们的混合物治疗21d,检测肿瘤组织生长、细胞凋亡、目的基因以及相关细胞因子表达情况。结果 C-kit在吉非替尼耐药的A431异种移植瘤中过表达,双重阻断EGFR和c-Kit信号有协同作用,引起细胞凋亡。结论 A431异种移植瘤模型中诱导的吉非替尼耐药可能与c-Kit过表达有关。EGFRIs和c-Kit抑制剂的联合治疗可能阻断这种耐药机制,抑制肿瘤细胞生长。

Caspase-3/Caspase-9活化与皮鳞癌1号方抑制A431细胞生长的关系研究

目的研究Caspase-3和Caspase-9活化与皮鳞癌1号方抑制A431细胞生长的关系。方法培养A431细胞,用不同浓度的皮鳞癌1号方分别作用于A431细胞;Hochest染色检测细胞凋亡形态;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞色素C含量;比色法测定Caspase-3和Caspase-9活性。结果 Hochest33258染色可见皮鳞癌1号方组A431细胞发生核固缩、凋亡小体等典型的凋亡形态学特征;与对照组比较,Cytc、Caspase-3、Caspase-9表达增加。结论 Caspase-3和Caspase-9的活化与皮鳞癌1号方可诱导A431发生凋亡有关。

辣木籽异硫氰酸酯抑制皮肤鳞状癌A431细胞的生长

研究辣木籽异硫氰酸酯(MITC)对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生长的影响。通过MTT法、克隆形成实验及流式细胞术检测经不同浓度MITC处理后的A431细胞增殖、凋亡和细胞周期的变化情况;采用异种移植瘤模型检测MITC对A431细胞体内生长的影响。研究结果表明,随着MITC浓度和处理时间增加,A431细胞活力逐渐降低,在12μM的MITC刺激72 h后,细胞存活率降低为10%(p<0.001);克隆形成实验表明,MITC(5和10μM)显著抑制A431细胞克隆形成,24 h的细胞克隆形成率分别从100%降低到63.22%(p<0.001)和26.07%(p<0.001);细胞凋亡和周期检测结果表明,当MITC处理细胞48 h后,细胞凋亡率分别从17.22%增加到31.73%(p<0.001)和44.77%(p<0.001),S期细胞从7.43%显著增加到14.44%(p<0.001)和17.43%(p<0.001)。体内实验结果表明,用MITC干预异种移植瘤小鼠20天后,小鼠肿瘤体积从1549.02 mm3降低到857.77 mm3(p<0.05);肿瘤重量从1.30 g降低到0.91 g(p<0.05)。以上结果表明,MITC在体外和体内均能够抑制A431细胞的生长。

新藤黄酸对人表皮癌细胞A431增殖和凋亡的影响

目的 观察新藤黄酸（gambogenic acid,GNA）对人表皮癌细胞A431增殖和凋亡的影响.方法 以体外培养的人表皮癌A431细胞株为研究对象,采用甲基噻唑基四唑检测GNA对A431细胞增殖活性的影响;倒置显微镜下观察GNA对A431细胞株细胞形态的影响;荧光显微镜下观察GNA对Hoechst 33342染色的A431细胞凋亡的影响;采用流式细胞仪检测膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙碇双染的A431细胞的凋亡率.结果 随着GNA剂量的增大,GNA对A431细胞增殖活性的抑制作用增强.倒置显微镜和荧光显微镜下观察显示,GNA作用的A431细胞形态发生明显的变化并出现显著的凋亡特征.流式细胞仪检测显示A431细胞凋亡率随着GNA作用剂量的增大而升高.结论 0.75～12.0 μmol/L GNA能够剂量依赖性地抑制A431的增殖.

circ_0001821靶向miR-203调控皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭

目的:探讨circ_0001821通过靶向miR-203调控皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,CSCC)A431细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的分子机制。方法:选取2018年2月至2019年8月海南医学院第二附属医院收治的39例CSCC患者的癌及配对癌旁组织,以及人CSCC细胞系A431,用qPCR法检测CSCC癌和癌旁组织中circ_0001821的表达水平。利用脂质体转染技术,分别将si-circ_0001821、si-NC、miR-203 mimic、miR-NC、si-circ_0001821与anti-miR-NC、si-circ_0001821与anti-miR-203转染至A431细胞,用qPCR法检测转染细胞中circ_0001821和miR-203的表达水平,MTT法、流式细胞术和Transwell实验分别检测A431细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭能力,WB法检测细胞中增殖、凋亡、迁移及侵袭相关蛋白的表达水平。通过Circinteractome数据库预测circ_0001821与miR-203存在结合位点,双荧光素酶报告基因实验验证circ_0001821与miR-203的靶向关系。结果:CSCC组织中circ_0001821的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01)。转染si-circ_0001821可显著降低细胞中circ_0001821的表达水平(P<0.01),降低细胞增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.01),提高细胞凋亡率(P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验证实,circ_0001821可靶向结合miR-203。转染miR-203 mimic可显著降低A431细胞的增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.01),提高细胞凋亡率(P<0.01)。共转染si-circ_0001821与anti-miR-203可明显逆转下调circ_0001821表达对A431细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的调控作用。结论:circ_0001821通过靶向miR-203调控CSCC细胞A431的增殖、迁移、侵袭能力及细胞凋亡。

HPV16 E7对A431细胞中Smad7表达的影响

目的研究HPV16 E7对A431表皮鳞癌细胞Smad7表达的影响,并分析其潜在的意义。方法应用基因工程技术转染并筛选出稳定表达HPV16 E7的A431细胞,采用qRT-PCR、Western blotting及激光共聚焦技术,观察并比较转染前后A431细胞中Smad7的表达。结果 A431细胞中Smad7的表达强度随转染HPV16 E7后时间的延长而升高(P<0.05)。Smad7蛋白的亚细胞定位,存在胞浆向胞核移位的现象。结论稳定高表达HPV16 E7后的A431细胞中Smad7表达水平升高,并可以影响Smad7的细胞定位。

芳姜黄酮对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞迁移、侵袭及凋亡的影响和机制研究

为研究芳姜黄酮(Ar-Turmerone)对人鳞状细胞癌A431细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及机制。实验采用CCK-8法检测抑制率,吉姆萨染色观察细胞形态,划痕实验和Transwell小室实验研究细胞迁移和侵袭能力的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率。此外,通过实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)与蛋白质印迹法(western blot)法检测mRNA和蛋白表达。siRNA阻断Notch1,Hes1和PTEN,检测相应的下游mRNA和蛋白的表达变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果发现,芳姜黄酮可以抑制A431细胞增殖,使细胞形态发生改变,抑制细胞体外迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。经过芳姜黄酮处理后,Notch1,Hes1,PTEN的mRNA和蛋白表达升高。沉默Notch1,Hes1 mRNA和蛋白表达低于单纯给药组,而沉默Hes1,PTEN mRNA和蛋白表达也低于单纯给药组;沉默PTEN后,与单纯给药组相比,细胞死亡率降低。总之,芳姜黄酮可以抑制人鳞状细胞癌A431细胞的增殖并促进其凋亡,且具有抑制体外迁移和侵袭的作用,其促进细胞凋亡的机制是通过Notch1/Hes1/PTEN途径实现的。